AF1q在神经发育中的功能及调控机制研究

发布时间：2017-09-06 14:31

  本文关键词：AF1q在神经发育中的功能及调控机制研究

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【摘要】：研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是老年痴呆症最常见的病因,大约占老年痴呆症的三分之二。随着中国人口老龄化进程的加速,AD患病率也在逐年增加。晚期AD患者丧失独立生活的能力,严重危害老年人群的健康。AD是一种以记忆障碍为主的慢性、进行性的神经退行性疾病,其主要的神经病理学特征为老年斑形成、神经原纤维缠结和神经元丢失。目前,AD的发病机制仍未完全明了,因而也缺乏有效的治疗方法。成年神经再生的研究是神经科学中发展快速的一个领域。现在普遍认为成年脑内神经干细胞具有增殖、迁移和分化的能力,并最终能整合到神经元网络中,在各种脑损伤以及AD等神经系统变性疾病中发挥着重要作用。大量研究表明,在AD进展过程中,海马神经再生会发生改变。神经再生可以补偿损伤神经元的功能,为AD的治疗提供了一个新方法。目前,用于治疗AD的神经干细胞疗法主要有体外干细胞移植和自体神经干细胞激活两种方法。应用外源性神经干细胞移植治疗AD的尝试取得了较大的进展,但因面临伦理质疑、干细胞资源匮乏以及移植后的免疫排斥反应等问题而受到诸多限制。与异体神经干细胞相比,自体神经干细胞具有来源稳定、无免疫原性、无致瘤性、不引起内环境紊乱及操作简便等特点,而成为AD治疗的研究热点。因此,激发自身神经干细胞的活化最终达到自身修复的目的是AD治疗的一个崭新理念,具有广阔的应用前景,对此方面的研究将为AD等神经退行性疾病的机制研究和治疗提供新的思路。成年海马神经再生受多种内源性和外源性因素的调节,例如Wnt信号通路。Wnt信号通路对神经系统的发育、海马区神经再生的增殖和分化有着重要的调控作用。Wnt信号可以增强来源于大脑中枢神经系统的神经干细胞的增殖,而下调Wnt信号后海马区的神经干细胞的增殖则受到抑制。此外,Wnt信号通路不仅与神经干细胞再生直接相关,而且还参与AD的病理发生。综上所述,与Wnt信号通路相关的特异性蛋白或化合物将可能会激发自身神经干细胞的活化,而达到治疗AD的目的。第一部分AFlq的转录调控研究目的研究在阿尔茨海默病中AFlq的表达是否具有特异性,并明确与神经发育及阿尔茨海默病致病相关的转录调控因子REST蛋白对AF1q的转录调控的分子机制,从而进一步认识两者的重要关系。研究方法1.应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)法检测AD鼠模型B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE9)及其同窝阴性小鼠中AF1q表达的差异性。分别取出生后7天,1个月,3个月,6个月,9个月,12个月的(APPswe,PSEN1dE9)双阳性的B6C3-Tg小鼠及其同龄的同窝阴性小鼠中大脑皮层,采用TRIzol提取组织的总RNA,应用Takara PrimeScriptTM逆转录试剂盒逆转录为cDNA,应用SYBR Green Real-time PCR检测AF1qmRNA的表达情况。2.研究转录因子REST对人类AF1q基因的转录调控。2.1细胞转染：应用Lipofectamine 2000分别将REST高表达质粒pREST或敲除质粒psiREST及各自对照转染HEK293细胞,48小时后收集各组细胞,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内源性AF1q mRNA表达的变化。2.2启动子质粒的构建：利用PCR技术从人类基因组中得到AF1q启动子序列,并将其克隆到没有启动子活性的pGL3-Basic载体中,构建质粒pAF1qpromoter,应用Lipofectamine 2000转染HEK293细胞,24小时后利用Luciferase技术检测启动子活性。2.3将REST高表达质粒pREST或其空白对照与启动子质粒pAF1qpromoter或其对照pGL3-Basic应用Lipofectamine 2000共同转染HEK293细胞,24小时后收集细胞,Luciferase检测REST对AF1q启动子活性的影响。3.AF1q启动子功能性NRSE位点的确定。3.1结合位点预测：计算机Jaspar软件预测AF1q启动子区域的REST作用的结合位点即NRSE位点。3.2构建含有或者不含有预测NRSE位点的截短AF1q启动子载体,应用Lipofectamine 2000转染HEK293细胞,24小时后Luciferase检测构建的截短载体启动子活性；并且分别与REST高表达质粒或者其对照质粒应用Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,Luciferase检测REST对不同截短启动子的作用功能,初步找出转录因子REST对AF1q启动子的调控位点。3.3凝胶迁移率试验(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)试验从体内体外两方面验证功能性NRSE位点。4.应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)法检测AFlq与REST在C57BL/6小鼠大脑发育过程中的表达情况。分别取胚胎13.5,18天(E13.5,E18),及出生后1,7,14天(P1,P7,P14)的小鼠的大脑皮层,采用TRIzol提取大脑皮层组织的总RNA,应用TakaraPrimeScriptTM逆转录试剂盒逆转录为cDNA,应用SYBR Green Real-time PCR检测Rest和AF1qmRNA的表达情况。5.统计分析：应用SPSS 17.0软件处理数据,采用t检验和Sperman相关分析对数据分别进行差异性分析,P0.05为差异有统计学意义。研究结果1.与同龄阴性对照小鼠相比,APPswe/PSEN1dE9双阳性B6C3-Tg小鼠中AF1qmRNA的表达量相对较低；提示AFlq水平的降低可能与AD的致病相关,AF1 q可能是参与AD的致病过程的相关分子。2.REST可以抑制人类AF1q基因的转录。2.1 REST高表达后内源性AF1qmRNA的表达量降低,而敲除REST后内源性AF1q mRNA表达量升高：提示转录因子REST能够下调AF1q的转录。2.2与pGL3-Basic相比,Luciferase检测示pAF1qpromotor的荧光素酶活性明显升高,说明克隆的AF1q启动子序列具有启动子活性。2.3与对照组相比,REST能够抑制AF1q启动子的活性,说明REST通过抑制AF1q启动子的活性来下调AF1q的转录。3.AFlq基因启动子功能性NRSE位点的确定。3.1计算机Jaspar软件预测AF1q启动子区域的具有2个结合位点,分别位于-383--363bp和+422～+442bp；3.2 Luciferase检测证实构建的截短启动子均具有启动子活性,而REST能够下调包含-383～-363bp位点的启动子,当-383～-363bp不包含时REST的下调作用消失,初步证实REST作用的功能性NRSE位点位于-383-363bp；3.3 EMSA和ChIP均验证功能性NRSE位点位点位于-383--363bp。4.AF1q与Rest在正常成年小鼠大脑神经发育过程中呈负相关。当Rest表达比较高时,Af1q表达处于低水平,而当Rest表达比较低时,Af1q表达处于高水平,说明两者有负相关；进一步证实REST对AF1q的负调控作用。结论1.AF1q在AD鼠中的表达明显低于正常对照组小鼠。2.REST可以抑制人类AF1q基因的转录。3.人类AF1q基因启动子区-383-363bp可与REST结合,发挥功能性NRSE位点的作用。4.AF1q与Rest在正常小鼠大脑神经发育过程中呈负相关。第二部分AFlq通过TCF7激活Wnt信号通路参与神经发育的过程的研究研究目的研究AF1q在神经发育中的功能作用；并揭示AFlq作为Wnt信号通路的新分子,调控Wnt信号通路的分子机制；明确AF1q与TCF7之间相互作用,以完善Wnt信号通路。研究方法1.研究AFlq在神经源性细胞SH-SY5Y中的功能。1.1质粒的构建及细胞转染：构建AF1q高表达质粒pcDNA3.1-AF1q-6myc,以及带绿色荧光蛋白的pEGFP-AF1q-C3,上调AF1q的表达,应用Lipofectatmine2000转染神经源性细胞SH-SY5Y细胞,48小时后RT-PCR、Western blot方法检测AFlq的表达,或者荧光显微镜直接观测pEGFP-AF1q-C3质粒的转染效率。1.2病毒包装及细胞感染：分别包装携带AFlq表达载体的慢病毒,感染SH-SY5Y细胞,上调AFlq表达,48小时后RT-PCR, Western blot方法检测AF1q的表达；应用Blastin药物筛选获得稳定感染细胞系,RT-PCR、Western blot方法检测病毒感染稳筛后AFlq表达情况。1.3将AFlq表达质粒pEGFP-AF1q-C3和对照质粒应用Lipofectamine 2000转染SH-SY5Y细胞中,共聚焦显微镜下观察AF1q在细胞中的定位。1.4 MTT检测细胞的增殖：将筛选稳定表达的AFlq的SH-SY5Y细胞系及对照组按合适的密度种植到96孔板中,分别在细胞增殖的第0,1,2,3,4,5天,对细胞进行MTT检测,绘制增殖曲线。1.5 EdU检测细胞的增殖：将筛选稳定表达的AF1q的SH-SY5Y细胞系及对照组按合适的密度种植到共聚焦小皿中,孵育24小时后,待细胞贴壁完善后进行EdU染色,荧光显微镜下观察细胞的增殖状态,并计数分析。1.6流式细胞术检测细胞周期：将筛选稳定表达的AFlq的SH-SY5Y细胞系及对照组细胞收集后,70%冰乙醇在-20℃条件下固定1小时,经PI染色后流式细胞仪检测细胞周期。2.研究AFlq对神经干细胞的增殖和分化的作用。2.1神经干细胞的获取：取胚胎13天的胎鼠,断头取脑,分离海马,使用木瓜胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,神经干细胞培养基培养,培养5-7天后形成神经球,细胞免疫化学检测神经干细胞标记蛋白Nestin,确定培养的神经球为神经干细胞。2.2病毒感染：将携带AFlq表达载体的慢病毒,感染神经干细胞,上调AFlq表达,48小时后荧光显微镜观测感染效率,并且RT-PCR、Western blot方法检测病毒感染后AF1q表达情况。2.3测量神经干细胞球大小和数目：将高表达AFlq或对照组的神经干细胞消化传代培养3天,显微镜下观察两组神经干细胞球大小和数目的差异性。2.4检测神经干细胞分化能力：将慢病毒感染后并稳定表达的神经干细胞传代,RT-PCR检测神经元前体Neurogenin-1的表达差异；培养一周后加入神经干细胞分化培养基诱导干细胞分化,细胞免疫荧光检测神经元标记蛋白MAP-2和星形胶质细胞标记蛋白GFAP的表达,检测神经干细胞的分化能力。3.AF1q作用于Wnt信号通路的分子机制研究。3.1 TOP-FlashFOP-Flash荧光素酶活性检测：在HEK293细胞中分别应用Lipofectamine 2000转染AFlq高表达载体和对照质粒,转染24小时后进行TOP-FlashFOP-Flash荧光素酶活性检测。3.2免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)实验检测AFlq蛋白与TCF7结合作用：将携带6myc标签AFlq编码基因全长表达载体,分别与携带Flag标签的TCF7,LEF1表达载体或β-catenin载体,应用Lipofectamine 2000共转染HEK293细胞,Co-IP实验检测验证AFlq蛋白与Wnt细胞通路关键分子的结合作用。3.3 Western blot分析AFlq结合TCF7蛋白后TCF7蛋白的稳定性：将AFlq表达载体或对照质粒和TCF7分别应用Lipofectamine 2000共转染HEK293细胞,转染48小时候后加入终浓度100ug/ml的蛋白合成抑制剂CHX,分别在加药0h、3h、 6h、 9h、12h和24h后收集细胞,Western blot分析TCF7蛋白的表达变化。3.4 TCF7的核转录：将AFlq表达载体和对照质粒分别与TCF7应用Lipofectamine 2000共转染HEK293细胞,转染48小时后分别提取核质蛋白,Western blot分析核质中TCF7蛋白的表达。3.5 EdU检测AFlq通过TCF7发挥功能：构建TCF7敲除质粒psiTCF7, Lipofectamine 2000转染HEK293细胞,Western blot分析敲除效果；将AFlq高表达质粒分别与psiTCF7或其对照应用Lipofectamine 2000转染SH-SY5Y细胞,转染48小时后,EdU检测细胞的增殖。3.6 Co-IP明确AFlq与TCF7的结合位点：构建了AFlq的系列缺失表达载体,包括1-30aa、30-90aa、1-60aa、60-90aa、 1-20aa、20-80aa、 1-10aa,10-90aa、 20-30aa和11-20aa,这些系列缺失载体分别与TCF7表达质粒应用Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,利用CO-IP技术分析,确定TCF7的结合位点。3.7 AFlq的磷酸化与TCF7的作用关系。3.7.1制备AFlq11位丝氨基酸突变为苯丙氨酸的质粒pAF1qS11F,将pcDNA3.1-AF1qS11F-6myc,与pcDNA3.1-AF1q-6myc及对照质粒分别转染HEK293细胞,转染48小时后Western blot检测AFlq蛋白表达的差异。3.7.2 Western blot检测AFlq蛋白稳定性：将pcDNA3.1-AF1qS11F-6myc,与pcDN A3.1-AF1q-6myc及对照质粒分别转染HEK293细胞,转染48小时后加入终浓度100ug/ml的蛋白合成抑制剂CHX,分别在加药Oh、3h、6h、 9h、12h和24h后收集细胞,Western blot分析AFlq蛋白的表达变化。3.7.3 TOP-FlashFOP-Flash报告系统：pcDNA3.1-AF1qS11F-6myc与pcDNA3.1-AF1q-6myc及对照质粒分别应用Lipofectamine 2000转染HEK293细胞,24小时后TOP-Flash FOP-Flash分析Wnt信号通路的激活作用。3.7.4 EdU测细胞的增殖：分别应用Lipofectamine 2000将SH-SY5Y细胞转染pcDNA3.1-AF1qS11F-6myc与pcDNA3.1-AF1q-6myc及对照质粒,48小时后EdU检测细胞的增殖。4.统计分析：应用SPSS 17.0软件处理数据,采用t检验进行差异性分析,P0.05为差异有统计学意义。研究结果1.AFlq促进细胞的增殖。1.1RT-PCR结果显示与对照组相比,构建的pcDNA3.1-AF1q-6myc质粒以及pEGFP-AF1q-C3质粒,均能够上调AFlq的表达。荧光显微镜下观察pEGFP-AF1q-C3能够表达绿色荧光融合蛋白。1.2 RT-PCR结果显示与对照组相比,含AF1q表达载体的慢病毒lenti-AF1q能够上调AFlq表达。1.3共聚焦显微镜观察发现AF1q主要定位于细胞浆中,细胞核中比较少,而在处于细胞分裂状态的细胞中AFlq在核膜周围有颗粒状汇集,表明AFlq主要在细胞浆中发挥作用。1.4 MTT检测表明,与对照组相比,AFlq高表达能够促进SH-SY5Y细胞的增殖。1.5 EdU检测表明,与对照组相比,AFlq高表达能够促使SH-SY5Y细胞处于增殖状态的增多。1.6流式细胞术检测细胞周期显示,与对照组相比,AF1q高表达能够促进细胞处于S期,G2期且使处于G1期的细胞比例减少。说明AFlq能够影响细胞周期。2.AF1q促进神经干细胞的增殖并抑制其向神经元方向分化。2.1细胞免疫化学Nestin染色证实分离获得的悬浮细胞球为神经干细胞。2.2RT-PCR证实AFlq表达载体的慢病毒lenti-AF1q能够感染神经干细胞,并上调AFlq表达。2.3显微镜下观察发现,与对照组相比,AFlq高表达能够促进神经干细胞球变大和增加半径较大的神经干细胞球的数目。2.4 RT-PCR检测证实与对照组相比,AFlq高表达后,神经元前体Neurogenin-1的表达量降低；细胞免疫荧光检测神经元标记蛋白MAP-2和星形胶质细胞标记蛋白GFAP的表达结果显示,与对照组相比AF1q高表达导致神经元标记蛋白MAP-2相对含量降低；综上所述,AFlq能够抑制神经干细胞向神经元方向的分化。3.AFlq通过与TCF7相互作用激活Wnt信号通路。3.1 TOP-Flash FOP-Flash荧光素酶活性检测表明AFlq能够激活Wnt信号通路。表明AFlq有可能是Wnt信号通路的新的分子。3.2 Co-IP实验检测AFlq蛋白能够与TCF7相互作用,而与LEF1或β-catenin没有相互结合。说明AFlq参与Wnt信号通路可能是通过与TCF7的相互作用。3.3 Western blot分析显示,与对照组相比,在AFlq存在的条件下,TCF7蛋白的表达量增加,而且加入CHX后,TCF7的降解速率明显减慢。说明AF1q能够稳定TCF7蛋白的稳定性。3.4 Western blot分析显示,与对照组相比,AF1q高表达后,细胞核中TCF7的含量明显增加,说明AF1q能够促进TCF7的核转录。3.5干扰TCF7蛋白的表达,导致AF1q促进细胞增殖的效果降低,说明AF1q是通过TCF7来间接的促进细胞的增殖。3.6 Co-IP明确AF1q与TCF7的结合位点位于AF1q蛋白上第11-20氨基酸位点。3.7 AF1q11位点的磷酸化是与TCF7结合并发挥作用的关键位点。3.7.1 pcDNA3.1-AF1qS11F-6myc为AF1q11位点丝氨酸突变为苯丙氨酸的质粒,其中第11位点不能够被磷酸化,Western blot示pcDNA3.1-AF1qS11F-6myc主要表达非磷酸的的分子量较小的AF1q,而pcDN A3.1-AF1q-6myc质粒表达的AF1q蛋白中磷酸化和非磷酸化的AF1q均有表达；3.7.2 Western blot检测示pcDNA3.1-AF1q-6myc蛋白表达的AF1q蛋白的稳定性比pcDNA3.1-AF1qS11F-6myc表达的AF1q蛋白的稳定性高：3.7.3 TOP-Flash FOP-Flash检测系统显示与pcDNA3.1-AF1q-6myc相比,pcDNA3.1-AF1qS11F-6myc对Wnt信号通路的激活作用减弱；3.7.4 EdU示与pcDN A3.1-AF1q-6myc相比,pcDNA3.1-AF1qS11F-6myc促进细胞增殖作用减弱。结论1.AF1q促进SH-SY5Y细胞的增殖。2.AF1q促进神经干细胞的增殖并抑制其向神经元方向的分化。3.AF1q通过与TCF7相互作用激活Wnt信号通路。4.AF1q与TCF7的作用位点位于AF1q蛋白11-20氨基酸位点。5.11位点的磷酸化为AF1q发挥功能的关键位点。
【关键词】：阿尔茨海默病 MLL-AF1q易位融合基因 神经元限制性沉默因子 负调控 MLL-AF1q易位融合基因 T细胞因子7 Wnt信号通路 神经发育
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 中文摘要9-18
• ABSTRACT18-29
• 符号说明29-31
• 第一部分 AF1q的转录调控31-76
• 第一章 前言31-34
• 第二章 材料与方法34-61
• 2.1 实验材料及试剂34-39
• 2.2 实验仪器39-40
• 2.3 质粒的构建40-48
• 2.4 细胞培养48-50
• 2.5 细胞转染50
• 2.6 双荧光素酶报告基因分析50-51
• 2.7 RNA提取及RT-PCR51-53
• 2.8 Western Bloting蛋白分析53-56
• 2.9 凝胶迁移率实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)56-58
• 2.10 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)58-60
• 2.11 实验动物60
• 2.12 核苷酸序列编号60
• 2.13 数据分析60-61
• 第三章 实验结果61-71
• 3.1 Af1q在阿尔茨海默病鼠模型中表达相对较低61-62
• 3.2 REST能够抑制人类AF1q基因的表达62-64
• 3.3 确定AF1q基因启动子上功能性NRSE结合位点64-69
• 3.4 AF1q与Rest在小鼠脑内表达呈负相关69-71
• 第四章 讨论与总结71-74
• 参考文献74-76
• 第二部分 AFlq通过TCF7激活Wnt信号通路参与神经发育过程的研究76-120
• 第一章 前言76-78
• 第二章 材料与方法78-92
• 2.1 实验材料和试剂78
• 2.2 主要实验仪器78-79
• 2.3 Western blot胶的配制79-80
• 2.4 慢病毒的包装、浓缩和感染80-81
• 2.5 表达载体的构建81-85
• 2.6 流式细胞术检测细胞周期85-86
• 2.7 细胞培养及传代86
• 2.8 神经干细胞的培养86-87
• 2.9 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)87-88
• 2.10 核蛋白的提取88-89
• 2.11 神经球Nestin免疫荧光染色89
• 2.12 MTT检测细胞增殖89-90
• 2.13 EdU检测细胞增殖90-91
• 2.14 数据分析91-92
• 第三章 实验结果92-110
• 3.1 AF1q促进SH-SY5Y细胞以及神经干细胞的增殖抑制向神经元方向分化92-98
• 3.2 AF1q通过TCF7激活Wnt信号通路98-104
• 3.3 TCF7与AF1q结合位点的确定104-105
• 3.4 磷酸化的AF1q起重要作用105-110
• 第四章 讨论与总结110-117
• 参考文献117-120
• 第三部分 文献综述 AF1q在相关疾病中的作用及其机制研究进展120-131
• 参考文献128-131
• 总结131-132
• 文章创新点及意义132-133
• 致谢133-135
• 攻读学位期间发表的学术论文目录135-136
• 学位论文评阅及答辩情况表136-137
• English anicles Ⅰ137-150
• English anicles Ⅱ150-169

【共引文献】

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本文编号：803677