氯化锂对血管性认知功能障碍小鼠认知功能的影响及机制研究

发布时间：2017-09-08 15:50

  本文关键词：氯化锂对血管性认知功能障碍小鼠认知功能的影响及机制研究

  更多相关文章： 血管性认知功能障碍 反复脑缺血再灌注 氯化锂 氧化应激损伤 凋亡 信号通路

【摘要】：血管性认知功能障碍(vascular cognitive impairment,VCI)是由各种脑血管疾病引起的以学习记忆功能损害为主要症状的智能障碍综合征。随着我国老年人口规模的增加和老龄化速度的加快,脑血管病的发病率也逐年增高,严重影响了老年人的生活质量,并有年轻化的趋势。脑血管病除了引起肢体功能障碍以外,还会引起认知功能障碍和情绪异常。因此早期采取积极有效的预防和治疗对减轻患者个人及家庭的负担具有重要意义。反复脑缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR)损伤是VCI重要的病理生理学机制之一。制备反复脑IR动物模型能很好的模拟临床患者VCI的过程,是研究VCI发病机制的有效方法。众所周知,锂剂是一种治疗双向情感障碍的情绪稳定剂。近年锂剂也作为一种治疗神经退行性疾病和脑血管性疾病的神经保护性药物使用。但是,锂剂对反复脑IR引起学习记忆损害的分子机制还不十分清楚。研究表明,海马是学习、记忆的主要场所,也是缺血易损区。蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)信号通路是神经营养因子依赖性信号通路中的主要成员,在改善海马学习记忆中发挥重要作用。反复脑IR导致大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)生成进而引起脂质过氧化损伤,及时有效的减轻氧化应激损伤可能是防治VCI的可行方法之一。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)是脑内最丰富的神经生长因子,缺乏生长因子可促进神经凋亡。BDNF也能通过刺激B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)家族成员表达发挥抗凋亡作用达到神经保护的效果。c AMP反应元件结合蛋白(c AMP response element binding protein,CREB)是BDNF基因表达的转录调节因子,通过133位丝氨酸磷酸化激活的CREB参与突触可塑性、长时记忆形成和巩固。基于上述研究背景,我们采用反复三次结扎双侧颈总动脉(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)的方法,建立反复脑IR损伤致VCI小鼠模型,术前或术后应用不同剂量氯化锂(lithium chloride,Li Cl)进行干预,观察:(1)Li Cl是否能通过调节Akt、GSK-3β蛋白表达改善小鼠学习记忆功能和海马组织形态学异常;(2)Li Cl是否能通过调节MDA含量、SOD活性、GSH-PX活性和CAT活性等指标,抑制氧化应激损害;(3)Li Cl是否能通过调节Bcl-2、Bax、BDNF、CREB基因或蛋白表达抑制凋亡、激活BDNF/CREB信号通路以改善认知功能。第一部分氯化锂对血管性认知功能障碍小鼠Akt/GSK-3β通路的影响目的:通过反复三次BCCAO法建立VCI小鼠模型,观察术后2周、4周、6周Akt和GSK-3β活性改变是否参与了反复脑IR致学习记忆损害,并进一步探讨2mmol/Kg Li Cl术后给药是否能通过增强或抑制这种变化发挥治疗认知功能障碍的神经保护作用。方法:清洁级健康雄性C57Bl/6小鼠(C57小鼠)144只,随机分为4组:(1)氯化钠假手术组(Na Cl-treated sham group,n=36);(2)氯化钠模型组(Na Cl-treated model group,n=36);(3)氯化锂假手术组(Li Cl-treated sham group,n=36);(4)氯化锂模型组(Li Cl-treated model group,n=36)。每组于术后2周、4周、6周进行观察(每亚组12只)。模型组采用双侧颈总动脉结扎20min,放开10min,反复循环三次的方法制备VCI模型。Li Cl组小鼠术后给予每天一次腹腔注射2mmol/Kg Li Cl。最后一次给药的次日,采用水迷宫自动记录仪对所有存活小鼠进行为期4天的水迷宫实验,记录第3天和第4天小鼠找到逃生梯的时间(游泳时间)和进入盲端的次数(错误次数)作为评测学习和记忆功能的指标。行为学测试结束后,采用HE染色观察小鼠海马组织形态学变化,TUNEL染色观察海马组织神经元凋亡变化,Western blot法分析Akt和GSK-3β蛋白表达变化。结果:在Na Cl和Li Cl模型组小鼠,死亡率分别为16.67%和11.11%。其中,Na Cl模型组小鼠术后2周、4周、6周各死亡小鼠2、1、3只;Li Cl模型组小鼠术后2周、4周、6周各死亡小鼠1、1、2只。假手术组小鼠术后未见死亡。行为学测试中,术前各组小鼠学习阶段和记忆阶段游泳时间和错误次数无明显差异,认知功能水平基本相同(P0.05)。术后,与假手术组相比,模型组小鼠学习阶段和记忆阶段游泳时间均延长,错误次数均增多(P0.05)。与Na Cl组小鼠相比,Li Cl组小鼠游泳时间明显缩短,错误次数明显减少(P0.05)。在术后2周、4周、6周整个观察期间,这种作用持续存在,但以术后4周最明显。HE染色结果发现,Na Cl和Li Cl假手术组小鼠海马锥体细胞数量多,排列紧密有序,细胞核大而圆,核仁明显,极少见TUNEL阳性细胞。相比之下,Na Cl模型组小鼠术后4周、6周海马锥体细胞数量减少,排列松散,细胞核固缩深染,核仁消失,并可见大量TUNEL阳性神经元(P0.05)。术后4周损伤最明显,部分区域仅见少量神经元存活。Li Cl组细胞数量减少和核固缩不明显,凋亡细胞数量减少(P0.05)。尤其在术后4周和6周改善明显。Western blot法检测蛋白表达发现,Li Cl模型组小鼠phospho-Akt Ser473和phospho-GSK-3βSer9蛋白表达增高(P0.05)。Na Cl模型组小鼠phospho-Akt Ser473和phospho-GSK-3βSer9蛋白表达比假手术组小鼠也有增高,但增高程度低于Li Cl组小鼠。这两种蛋白表达量以术后4周增高最明显。结论:反复脑IR法制备的VCI小鼠模型,能有效的模拟学习记忆功能障碍和海马形态学异常,给予术后不同时间2 mmol/kg Li Cl处理均可不同程度改善海马形态学异常,减轻凋亡反应,激活Akt/GSK-3β信号转导通路,提高VCI小鼠空间学习记忆能力,改善认知功能。第二部分氯化锂不同剂量和不同时间给药对血管性认知功能障碍小鼠认知功能和海马组织形态学的影响目的:给予VCI小鼠术前和术后2 mmol/kg或5 mmol/kg Li Cl处理,术后4周利用Morris水迷宫进行行为学测试,尼氏染色观察海马神经元形态学异常,进一步探讨Li Cl改善认知功能的作用。方法:60只C57小鼠随机分为6组:(1)假手术组(sham group);(2)模型组(vehicle group);(3)氯化锂低剂量术前组(pre-Li Cl-low model group,pre-Li-L);(4)氯化锂低剂量术后组(Li Cl-low model group,Li-L);(5)氯化锂高剂量术前组(pre-Li Cl-high model group,pre-Li-H);(6)氯化锂高剂量术后组(Li Cl-high model group,Li-H)。每组10只。模型组、Li Cl术前组和术后组均采用三次BCCAO致反复脑IR法制备VCI模型。Li Cl术前组于造模前连续7天给予每天一次2 mmol/kg(低剂量)或5 mmol/kg(高剂量)Li Cl腹腔注射,Li Cl术后组于造模后给予每天一次2 mmol/kg(低剂量)或5 mmol/kg(高剂量)Li Cl腹腔注射,连续28天。最后一次给药的次日,所有存活小鼠进行为期6天的Morris水迷宫实验,测试小鼠空间学习记忆能力。(1)定位航行实验(Place navigation test):连续训练5天,每天训练6次,记录小鼠从入水到寻台成功的时间,即逃避潜伏期(escape latency),反映小鼠空间学习能力。(2)空间探索实验(Spatial probe test):在定位航行实验结束的第二天,撤除平台,记录小鼠60s内在原平台象限的停留时间占总时间的百分比(目标象限停留时间百分比)以及穿过原来平台所在位置的次数(穿台次数),反映小鼠空间记忆能力。行为学测试结束后,尼氏染色观察海马神经元形态学变化并对正常神经元进行计数。结果:在定位航行阶段,随着训练天数的增加,各组小鼠逃避潜伏期逐渐缩短。从训练第2天开始,VCI小鼠逃避潜伏期较假手术组小鼠明显延长,具有统计学差异(P0.05);第3天,低剂量术后组、高剂量术前组和高剂量术后组小鼠表现出逃避潜伏期较VCI模型组小鼠明显缩短(P0.05);第4、5天低剂量术前组、低剂量术后组、高剂量术前组和高剂量术后组小鼠逃避潜伏期均较VCI模型组小鼠明显缩短(P0.05),低剂量术后组差异最明显。同时经比较发现,高剂量术前组小鼠逃避潜伏期较低剂量术前组缩短,而高剂量术后组却较低剂量术后组延长,但均无统计学差异。在空间探索阶段,与假手术组相比,VCI模型组小鼠在目标象限停留时间百分比明显降低(P0.05),穿台次数也明显减少(P0.05)。与VCI模型组小鼠相比,低剂量术前组、低剂量术后组、高剂量术前组和高剂量术后组小鼠在目标象限停留时间百分比均明显增加(P0.05),穿台次数也明显增加(P0.05)。行为学测试完毕后,尼氏染色观察发现,假手术组小鼠海马CA1区锥体神经元排列紧密、均匀,层次清楚,细胞形态、大小正常,结构完整,胞核大而圆,核仁清晰可见,胞浆尼氏体丰富。与假手术组相比,术后4周VCI模型组小鼠CA1区锥体神经元缺失明显,排列疏松,锥体神经元形态不规则,神经元胞体呈梭形或多角形,胞核固缩,正常神经元计数明显减少(P0.05)。给予2mmol/Kg和5mmol/Kg Li Cl术前和术后给药处理后,上述异常都明显减轻,海马CA1区锥体神经元丢失明显减少,正常神经元计数明显增多(P0.05),细胞排列较为紧密有序,存活细胞边缘较清晰,胞体形态较饱满,可见少量胞核固缩,以低剂量术后组改善最明显。结论:反复脑IR损伤制备的VCI小鼠术后4周在Morris水迷宫测试中表现出明显的空间学习记忆功能受损,伴有海马CA1区神经元形态异常、数量减少,2mmol/Kg和5mmol/Kg Li Cl术前和术后给药都能明显改善行为学异常、增加存活神经元数量,以低剂量术后给药效果最好。第三部分氯化锂不同剂量和不同时间给药对血管性认知功能障碍小鼠海马组织氧化应激损伤的影响目的:观察反复脑IR后不同时间点海马组织MDA含量、SOD活性、GSH-PX活性和CAT活性的动态变化,探讨氧化应激损伤在反复脑IR中的作用,并观察Li Cl不同剂量和不同时间给药对海马组织MDA含量、SOD活性、GSH-PX活性和CAT活性的影响,探讨Li Cl是否能通过提高抗氧化酶活性和降低自由基作用,达到减轻氧化应激损伤、发挥脑保护作用。方法:第一阶段:24只C57小鼠随机分为6组:(1)假手术组(sham group);(2)术后1天组(1d);(3)术后3天组(3d);(4)术后7天组(7d);(5)术后14天组(14d);(6)术后28天组(28d)。每组4只。第二阶段:分组情况同第二部分。对术后不同时间点以及Li Cl不同剂量和不同时间给药的各组小鼠海马组织,采用硫代巴比妥酸法检测海马组织MDA含量,WST-1法检测SOD活性、化学比色法检测GSH-PX活性和可见光法检测CAT活性。结果:与假手术组相比,术后1天、3天、7天、14天和28天,MDA含量持续增高,7天时达到统计学差异(P0.05),28天时仍明显高于假手术组(P0.05)。而术后1天、3天、7天、14天和28天,SOD活性、GSH-PX活性和CAT活性均明显减低(P0.05),以7天时最明显(P0.05),28天时仍明显低于假手术组(P0.05)。与VCI模型组小鼠术后4周相比,2mmol/Kg和5mmol/Kg Li Cl无论术前和术后给药,都能明显降低MDA含量(P0.05)、提高SOD活性(P0.05)和GSH-PX活性(P0.05)。经SNK法两两比较发现,采用术前给药时,5mmol/Kg效果好;采用术后给药时,2mmol/Kg效果好,4组比较而言,以低剂量术后组最好,但均未达到统计学差异。与VCI模型组小鼠术后4周相比,2mmol/Kg和5mmol/Kg Li Cl无论术前和术后给药,都能不同程度提高CAT活性,但只有在低剂量术后组达到统计学差异(P0.05)。结论:反复脑IR后1天、3天、7天、14天和28天,氧化应激反应逐渐增强,引起自由基生成过多或清除能力下降,抑制多种抗氧化物酶活性,导致脂质过氧化损伤。2mmol/Kg和5mmol/Kg Li Cl无论术前和术后给药,都能通过提高多种抗氧化物酶活性,减弱氧化应激反应,减少自由基含量,发挥神经保护作用。第四部分氯化锂不同剂量和不同时间给药对血管性认知功能障碍小鼠海马组织凋亡蛋白和BDNF/CREB信号通路的影响目的:观察反复脑IR后不同时间点海马组织Bcl-2、Bax、BDNF蛋白的动态变化,探讨凋亡在反复脑IR中的作用,并检测术前或术后给予2mmol/Kg或5mmol/Kg Li Cl能否通过抑制VCI小鼠凋亡、上调BDNF和p-CREB等重要蛋白表达发挥神经保护作用。方法:按照第三部分进行分组和模型制备。Western blot法检测反复脑IR后不同时间点海马组织Bcl-2、Bax、BDNF蛋白的动态表达,实时荧光定量PCR(Real Time-q PCR,RT-q PCR)法和Western blot法检测术前或术后给予不同剂量Li Cl后Bcl-2、Bax、BDNF、CREB、p-CREB基因或蛋白的表达情况。结果:Western blot方法检测发现,与假手术组相比,VCI模型组小鼠术后不同时间点Bcl-2/Bax比值均降低(P0.05),术后7天达到最低。各时间点间Bcl-2蛋白表达无明显差异(P0.05)。与假手术组相比,反复脑IR损伤导致BDNF表达持续升高,但没有达到统计学差异(P0.05)。术前给予5mmol/kg Li Cl能明显上调反复脑IR导致的Bcl-2/Bax比值降低(上调35%)(P0.05)。术前和术后给予2mmol/kg Li Cl可将Bcl-2/Bax比值分别上调9%和17%,但不如高剂量术前组效果明显。各组Bcl-2蛋白的表达未见统计学差异(P0.05)。RT-q PCR结果发现,与假手术组相比,VCI模型组小鼠海马组织BDNF m RNA水平明显降低(P0.05)。与模型组相比,术前和术后给予Li Cl治疗都能明显增加BDNF m RNA水平(P0.05),在4个Li Cl处理组中,以低剂量术后组增高最明显。Western blot结果发现,与VCI模型组相比,术后2mmol/kg Li Cl能明显增加BDNF蛋白表达(上调51%,P0.05)。术前2mmol/kg,术前5mmol/kg和术后5mmol/kg Li Cl处理对BDNF的表达也分别上调了35%,32%和32%。术前5mmol/kg Li Cl能明显上调phospho-CREB Ser133蛋白表达(上调33%)(P0.05)。各组间CREB蛋白表达未见明显改变(P0.05)。结论:反复脑IR后1天、3天、7天、14天和28天,Bcl-2/Bax比值降低、BDNF蛋白表达持续升高,表明凋亡的发生可以一定程度上刺激机体发挥自身保护作用。2mmol/kg和5 mmol/kg Li Cl术前或术后给药都能不同程度抑制凋亡,增加BDNF和p-CREB蛋白表达改善认知功能。
【关键词】：血管性认知功能障碍 反复脑缺血再灌注 氯化锂 氧化应激损伤 凋亡 信号通路
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.1
【目录】：

• 中文摘要5-12
• 英文摘要12-20
• 英文缩写20-21
• 引言21-23
• 第一部分 氯化锂对血管性认知功能障碍小鼠 Akt/GSK-3β 通路的影响23-49
• 前言23-24
• 材料与方法24-34
• 结果34-36
• 附图36-41
• 附表41-44
• 讨论44-45
• 小结45
• 参考文献45-49
• 第二部分 氯化锂不同剂量和不同时间给药对血管性认知功能障碍小鼠认知功能和海马组织形态学的影响49-64
• 前言49
• 材料与方法49-52
• 结果52-54
• 附图54-59
• 附表59-61
• 讨论61-62
• 小结62
• 参考文献62-64
• 第三部分 氯化锂不同剂量和不同时间给药对血管性认知功能障碍小鼠海马组织氧化应激损伤的影响64-81
• 前言64-65
• 材料与方法65-71
• 结果71-73
• 附图73-75
• 附表75-76
• 讨论76-78
• 小结78
• 参考文献78-81
• 第四部分 氯化锂不同剂量和不同时间给药对血管性认知功能障碍小鼠海马组织凋亡蛋白和BDNF/CREB信号通路的影响81-98
• 前言81
• 材料与方法81-86
• 结果86-88
• 附图88-90
• 附表90-92
• 讨论92-93
• 小结93
• 参考文献93-98
• 结论98-99
• 综述一 氯化锂对突触可塑性的影响99-106
• 参考文献103-106
• 综述二 磷酸二酯酶与神经保护作用106-114
• 参考文献110-114
• 致谢114-115
• 个人简历115-11

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3 范鸣s，

本文编号：814926