磷酸二酯酶4抑制剂罗氟普兰抗抑郁药效学及机制研究

发布时间：2017-09-09 10:47

  本文关键词：磷酸二酯酶4抑制剂罗氟普兰抗抑郁药效学及机制研究

  更多相关文章： PDE4抑制剂 罗氟普兰 抗抑郁 神经发生 pCREB BDNF 高脂饮食 二甲双胍 学习 记忆

【摘要】：目的：本研究采用经典抑郁模型-慢性不可预知温和应激大鼠抑郁模型,对磷酸二酯酶-4(phosphodiesterase4,PDE4)抑制剂罗氟普兰的抗抑郁作用进行评价,并探讨其发挥抗抑郁作用的机制。PDE4能够特异性催化第二信使环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)水解,对细胞内cAMP的浓度调节起关键作用。PDE4抑制剂可以抑制PDE4的活性,增加细胞内cAMP的积聚,从而介导多种生物学作用。大量研究表明PDE4抑制剂具有显著的抗抑郁作用,但其致恶心呕吐的胃肠道不良反应严重阻碍了PDE4抑制剂的开发应用。罗氟普兰(]oflupram)为新型PDE4抑制剂,本课题组通过对其酶活性的测定发现罗氟普兰对PDE4CAT (PDE4共有催化域)的抑制强度约为经典PDE4抑制剂咯利普兰的44倍,对PDE4B2的抑制强度为咯利普兰的16倍左右,对PDE4D4和PDE4D5的抑制活性也均高于咯利普兰。前期在罗氟普兰对行为绝望小鼠模型的急性药效学评价中发现,罗氟普兰(0.03、0.06、0.12.0.25、0.5mg·kg-1)能显著缩短小鼠在强迫游泳实验和悬尾实验中的不动时间,而不影响小鼠自主活动；对其致呕吐潜能的考察发现,罗氟普兰灌胃给药后,比格犬在120min内不出现呕吐反应,提示罗氟普兰具有极低的致呕吐潜能。本课题旨在采用慢性不可预知温和应激(Unpredictable Chronic Mild Stress, CUMS)模型大鼠模拟抑郁症,评价新型PDE4抑制剂罗氟普兰抗抑郁作用并探讨其发挥抗抑郁作用的机制。 方法：建立慢性不可预知温和应激大鼠抑郁模型：雄性Wistar大鼠60只,体质量在180-240g之间。适应性饲养一周,将大鼠随机分成2组：正常对照组(无CUMS处理)10只、CUMS组(给予CUMS处理)50只,应激前对大鼠体重和糖水偏爱度进行检测(两组间体重与糖水偏爱度差异无统计学意义),然后开始接受应激处理。正常对照组大鼠不接受任何应激处理,慢性不可预知温和应激方法具体包括：鼠笼倾斜24h、湿笼24h、水平摇晃10min、4℃冰水游泳5min、束缚1h、饮水剥夺24h、食物剥夺24h、夹尾1min、昼夜颠倒24h、电击足底等,每日仅采用一种应激方法,各种应激方法随机应用。在造模第2周、4周、6周进行糖水偏爱度的测定来判定抑郁症模型是否成功。造模成功后CUMS组再重新分组：CUMS模型组(溶齐+CUMS)、阳性对照艾司西酞普兰组(Escitalopram5.0mg·kg-1+CUMS)、Roflupram给药组(Roflupram0.5、1.0mg·kg-1+CUMS),每组12只大鼠,并开始用药物/溶剂处理。药物/溶剂处理3周后进行行为学测试评价罗氟普兰的抗焦虑抗抑郁作用,包括敞箱实验(Open field test,OFT),高架十字迷宫实验(Elevated plus maze, EPM),糖水偏爱实验(Sucrose prefence test, SPT),强迫游泳实验(Forced swimming test, FST)。行为学测试完毕后,探索罗氟普兰抗抑郁的可能分子机制：酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测大鼠血清中皮质酮含量的变化,免役印迹法检测罗氟普兰对大鼠海马中磷酸化环磷腺苷反应元件结合蛋白(phosphorylated cAMP response-element binding protein, pCREB)、脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)蛋白水平的影响,反转录酶-聚合酶链锁反应法(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测罗氟普兰对大鼠海马、前额皮层BDNF mRNA基因水平的影响,免疫荧光法检测罗氟普兰对大鼠海马齿状回BDNF、pCREB水平的影响及对海马齿状回新生神经元数目的影响。 结果：(1)罗氟普兰对慢性不可预知温和应激大鼠焦虑及抑郁样症状的改善：在旷场实验中,各组大鼠水平得分与垂直得分差异没有统计学意义,说明罗氟普兰及CUMS均不影响大鼠的自主活动。但是在旷场实验的观察过程中,CUMS模型组大鼠排便量较正常对照组大鼠显著增加,出现焦虑样症状,而罗氟普兰(1.0mg·kg-1)及艾司西酞普兰(5.0mg·kg-1)均可降低大鼠在观察时间内的排便量,说明罗氟普兰及艾司西酞普兰可以缓解大鼠焦虑状态；正常对照组大鼠排便粒数平均为0.80±0.359, CUMS模型组大鼠的排便粒数显著增加至6.22±0.364(P0.001),给予罗氟普兰(1.0mg·kg-1)及艾司西酞普兰(5.0mg·kg-1)后大鼠的排便量降低至4.44±0.603(P=0.05)、3.75±0.977(P0.05)。 同样,在高架十字迷宫实验中也显示,与CUMS模型组相比,给予不同剂量的罗氟普兰(0.5、1.0mg·kg-1)和艾司西酞普兰5.0mg·kg-1后,大鼠在开臂停留时间均增加。正常对照组大鼠在开臂停留时间百分比为8.15±1.434, CUMS模型组大鼠在开臂停留时间百分比降低至3.43±0.893(P0.05)；艾司西酞普兰及罗氟普兰(1.0mg·kg-1)处理后大鼠在开臂停留时间百分比显著增加,分别为9.59±2.250(P0.05)、8.97±2.015(P0.05)。 液体消耗实验中,正常对照组大鼠糖水偏爱指数(Sucrose prefence index,SPI)为0.78±0.070, CUMS模型组大鼠经过应激后SPI降低至0.467±0.097(P0.05),5.0mg·kg-1艾司西酞普兰及0.5mg·kg-1,1.0mg·kg-1罗氟普兰处理后糖水偏爱指数显著升高,分别为：0.81±0.038、0.74±0.056、0.70±0.089(P0.05),说明药物处理后大鼠快感缺失的症状得到逆转。 强迫游泳试验中,与溶剂对照组比较,给予不同剂量的罗氟普兰(0.5、1.0mg·kg-1)和艾司西酞普兰(5.0mg·kg-1)处理均能显著缩短大鼠在强迫游泳试验中的不动时间,正常对照组大鼠不动时间平均为31.85±4.459s, CUMS模型组大鼠的不动时间增加至62.31±6.734s(P0.001),给予5.0mg·kg-1艾司西酞普兰及0.5,1.0mg·kg-1罗氟普兰处理后,大鼠的不动时间分别降低至36.87±4.559s (P0.001),40.61±5.422s (P0.01)、34.25±3.687s (P0.001). (2)罗氟普兰对海马pCREB水平的影响：免疫印迹结果显示,与正常对照组相比,CUMS模型组大鼠海马区域pCREB水平降低；而经过3周的艾司西酞普兰与罗氟普兰处理后,大鼠海马pCREB的表达水平均升高。同时,免疫荧光检测大鼠海马部位pCREB表达的结果也显示,经过艾司西酞普兰(5.0mg·kg-1)及罗氟普兰(1.0mg·kg-1)处理3周,CUMS诱导大鼠海马中pCREB水平的降低均得到逆转。 (3)罗氟普兰对海马BDNF mRNA水平的影响：RT-PCR结果显示,CUMS模型组大鼠海马mRNA水平较正常对照组相比显著降低,而罗氟普兰(1.0mg·kg-1)及艾司西酞普兰(5.0mg·kg-1)均可增加大鼠海马mRNA水平。正常对照组海马nRNA相对含量为1.00±0.00, CUMS处理后大鼠海马nRNA的相对含量降低至0.72±0.041(P0.01),给予5.0mg·kg-1艾司西酞普兰、1.0mg·kg-1罗氟普兰后,海马mRNA的相对含量分别升高至0.88±0.032(P0.05)、1.01±0.051(P0.001)。 (4)罗氟普兰对海马BDNF水平的影响：免疫印迹结果显示,与正常对照组相比,CUMS模型组大鼠海马区域BDNF水平降低；而经过3周的艾司西酞普兰与罗氟普兰处理后,CUMS诱导的大鼠海马BDNF表达水平的降低均得到逆转。同时,免疫荧光检测大鼠海马部位BDNF表达的结果也显示,经过艾司西酞普兰(5.0mg·kg-1)及罗氟普兰(1.0mg·kg-1)处理3周,CUMS诱导大鼠海马中BDNF水平的降低均被逆转。 (5)罗氟普兰对大鼠血清中皮质酮含量的影响：ELISA结果显示,与正常对照组相比,CUMS模型组大鼠血清中皮质酮水平显著升高,而罗氟普兰(0.5、1.0mg·kg-1)和艾司西酞普兰5.0mg·kg-1均能降低CUMS大鼠血清中皮质酮的水平。正常对照组大鼠血清皮质酮含量为30.26±2.267ng·ml-1, CUMS模型组大鼠血清皮质酮含量增加至73.22±5.897ng@ml-1(P0.001),给予5.0mg·kg-1艾司西酞普兰及0.5、1.0mg·kg-1罗氟普兰处理后,大鼠血清中皮质酮含量分别降至49.51±7.412(P0.05)、51.75±7.524(P0.05)、40.35±5.372(P0.01) ng·ml-1. (6)罗氟普兰对大鼠海马齿状回新生神经元数目的影响：免疫荧光(Immunofluorescence staining)结果显示,大鼠经慢性不可预知温和应激8周后,大鼠海马齿状回DCX标记的新生神经元数量减少,而大鼠给予艾司西酞普兰(5.0mg·kg-1)及罗氟普兰(1.0mg·kg-1)处理后,海马齿状回DCX阳性细胞数量均有不同程度增加。 结论：新型PDE4抑制剂罗氟普兰,通过抑制cAMP的水解,使CREB磷酸化增加,增加海马中BDNF的基因表达及蛋白含量,同时减少血清中皮质酮水平,促进海马齿状回神经发生,发挥显著的抗焦虑抗抑郁作用。 目的：二甲双胍(metformin, MET)是治疗2型糖尿病的一线药物,其可以减少肝糖原输出,增加胰岛素调节糖原的利用。已有研究表明二甲双胍可迅速透过血脑屏障产生如抗炎及神经保护作用,二甲双胍能否改善高脂饮食诱导的认知障碍还未明确,本实验将采用高脂饲料(high fat diet, HFD)饲养大鼠,诱发大鼠学习记忆障碍,探讨二甲双胍对高脂饮食诱导的大鼠学习记忆障碍的影响。 方法：30只SD大鼠,随机分为普通饲料饲养组和高脂饲料饲养组,高脂饲养组4周后随机分为HFD模型组,二甲双胍治疗组；二甲双胍溶解在饮水中,浓度为2mg/ml,连续给药4周后尾尖取血进行大鼠空腹血糖及糖耐量检测,并测定大焦虑样行为,方法包括高架十字迷宫实验、敞箱实验；接着进行大鼠认知功能的测试,行为学测试方法包括：水迷宫实验(Morris water maze test,MWM)、被动回避实验(Step-through passive avoidance test, PA)。 结果：(1)糖耐量检测发现,与正常对照组大鼠相比,八周高脂饲料饲养的大鼠糖耐量显著降低,而MET处理后,大鼠的糖耐量得到改善(P0.05)。 (2)敞箱实验结果显示,各组大鼠的水平得分和垂直得分均无显著差异,说明HFD和HFD合并MET处理不影响大鼠的自主活动性。 (3)高架十字迷宫实验结果显示,观察时间内各组大鼠进入开臂次数百分比与在开臂停留时间百分比均无显著差异,说明HFD和HFD合并MET处理后并不会诱导大鼠出现焦虑样症状。 (4)在水迷宫实验中的探索阶段,与正常对照组相比,HFD组大鼠穿越平台次数显著降低、第一次到达平台时间延长、在目标象限探索时间缩短(P0.05)；而MET处理后,大鼠穿越平台次数显著增加、第一次到达平台时间缩短、在目标象限探索时间延长(P0.05)。 (5)被动回避实验中,训练阶段各组大鼠逃避潜伏期无显著差异。而测试阶段,与正常对照组相比,HFD组大鼠逃避潜伏期缩短,进入暗箱次数增加,提示大鼠的学习记忆功能有一定的损伤,而二甲双胍组处理后,大鼠的逃避潜伏期较HFD组显著延长,进入暗箱次数减少,提示二甲双胍处理后大鼠的学习记忆得到一定的改善。 结论：二甲双胍处理不影响大鼠自主活动,也不会诱发大鼠出现焦虑症状,而且对高脂饮食诱导的学习记忆障碍有一定的改善作用。
【关键词】：PDE4抑制剂 罗氟普兰 抗抑郁 神经发生 pCREB BDNF 高脂饮食 二甲双胍 学习 记忆
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.4
【目录】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-15
• 第一部分 罗氟普兰对慢性不可预知温和应激大鼠焦虑抑郁样行为的影响及机制研究15-51
• 前言15-17
• 1. 实验材料17-22
• 2. 实验方法22-31
• 3. 实验结果31-46
• 4. 讨论46-51
• 第二部分 二甲双胍改善高脂饮食诱导的大鼠学习记忆障碍51-62
• 前言51-52
• 1 材料与方法52-54
• 2 实验结果54-60
• 3 讨论60-61
• 4 结论61-62
• 参考文献62-69
• 综述69-80
• 参考文献75-80
• 中英文缩略词表80-81
• 攻读学位期间发表论文81-82
• 致谢82-83

【共引文献】

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本文编号：820002