低分子量硫酸软骨素对Aβ引起神经毒性的防治作用及机制研究

发布时间：2017-09-11 07:25

  本文关键词：低分子量硫酸软骨素对Aβ引起神经毒性的防治作用及机制研究

  更多相关文章： 低分子量硫酸软骨素(LMWCS) 淀粉样蛋白β(Aβ) 神经保护 阿尔茨海默病(AD)

【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)又被称为老年痴呆,是一类常见的神经退行性疾病,它的临床特点是患者表现出学习记忆障碍或认知功能减退,病理特征是出现淀粉样蛋白p(Aβ)沉积产生的老年斑(SP)、神经纤维缠结(NFTs),以及神经细胞大量丢失或死亡。Ap在体外和体内实验中均表现出较明显的神经毒性,从而在AD的发病机制中起到了重要作用。因此,Ap可以作为神经细胞毒性的诱导分子,它在AD的治疗与药物的发现中发挥了巨大的作用。本课题的研究对象为低分子量硫酸软骨素(LMWCS),它是由来源于鲨鱼软骨中的硫酸软骨素C经过氧化降解,并用相对分子质量(Mr)截留值为2000 Da和5000 Da的超滤膜截留后得到的物质,将Mr2000 Da、2000-5000 Da、5000 Da的3个组分命名为LMWCS-A、B、C,氧化降解后的总组分命名为LMWCS-D,这4个组分的平均Mr分别为1173、3928、6146、5846。本研究是以Ap作为研究靶点,在体外观察了LMWCS 对 AP25-35损伤大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞以及神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的保护作用,并在细胞水平上探讨了LMWCS抗Aβ25-35申经毒性损伤的相关作用机制,还观察了LMWCS对侧脑室注射Aβ1-40所致AD小鼠模型学习记忆功能的影响及对其机制进行了初步的研究。1 LMWCS对Aβ25-35 引起神经细胞损伤的保护作用及其机制的研究本研究通过四甲基偶氮唑盐(MTT)的方法观察了不同Mr的LMWCS对AP25-35诱导PC12及SH-SY5Y细胞损伤的影响,结果发现Aβ25-35可以明显降低神经细胞的MTT还原能力,减少存活细胞的数量；而加入50、100和200μg/mL LMWCS预孵育后,Aβ25-35所引起神经细胞损伤受到了抑制,神经细胞的存活率增加,其中加入LMWCS-B的神经细胞存活率最高,并且随着LMWCS浓度增加,对神经细胞的改善作用增强,提示不同Mr的LMWCS均可明显抑制Aβ25-35所引起的神经细胞毒性,并且LMWCS-B(平均Mr为3928)对神经细胞的保护作用最明显。因此,后期实验均采用此LMWCS组分来进行。本研究还观察了经过LMWCS预孵育再加入Aβ25-35进行损伤、Aβ25-35与LMWCS共孵育以及Aβ25-35先进行损伤再加LMWCS保护3种处理方式的神经细胞的存活情况,从而确定LMWCS抗Aβ25-35神经毒性损伤的作用环节。结果发现,在这3种处理方式中Aβ25-35对神经细胞均有损伤,LMWCS给药组的细胞存活率高于模型组,并且LMWCS预孵育方式的细胞存活率高于其他方式,表明LMWCS能够多环节的抑制Aβ25-35的神经毒性。LMWCS能够抑制Aβ25-35诱导PC12和(?)SH-SY5Y细胞产生的神经毒性,但其抑制作用的相关机制不明确。因此,本研究在细胞水平上探讨了LMWCS保护Aβ25-35诱导神经毒性损伤的作用机制。结果发现,30μmol/L Aβ25-35可以明显诱导PC12和SH-SY5Y细胞发生凋亡,而加入50、100和200μg/ml的LMWCS预孵育后,PC12和SH-SY5Y细胞的凋亡均明显受到抑制,凋亡率随着浓度的增加而呈现剂量依赖性降低。深入研究LMWC S抗Aβ25-35所致神经细胞凋亡的作用机制发现,LMWCS能够明显抑制Aβ25-35诱导产生的神经细胞内游离Ca2+浓度升高、自由基的形成以及细胞内脂质过氧化产物含量的增加,还能够降低线粒体膜电位(MMP)以及抑制凋亡促进蛋白Bax和Caspase-9、-3蛋白表达的升高,并且可以激活凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,表明LMWCS抑制Aβ25-35诱导产生的神经细胞毒性损伤主要是通过抑制自由基的产生、提高自由基的清除速率、抑制线粒体障碍以及抑制细胞内游离Ca2+浓度的升高而增加了凋亡抑制相关蛋白的表达、阻断了下游凋亡促进蛋白的表达,从而最终抑制Aβ25-35诱导产生的PC12和SH-SY5Y细胞的凋亡。2 LMWCS对侧脑室注射Aβ1-40所致AD动物学习记忆功能的影响及机制的研究本研究利用侧脑室注射Aβ1-40所致老年痴呆症小鼠为模型,采用旷场实验(OFT)和Morris水迷宫(MWM)的方法观察LMWCS对AD小鼠学习记忆功能的改善作用,并在细胞及分子水平研究了LMWCS对AD小鼠作用的可能分子机制。结果表明,侧脑室注射Aβ1-40能够明显损伤小鼠的学习记忆功能,给予LMWCS后,在OFT测试中,Ⅰ.MWCS增加了AD小鼠在盒内的穿越格数、站立次数以及小鼠进行自我修饰的次数；在MWM测试的过程中,LMWCS可以缩短小鼠潜伏期和游泳路程,在空间探索实验中可以减少AD小鼠第一次到达原平台的时间、增加小鼠穿越原平台区域的次数、增加小鼠在目标象限的时间和路程,从而说明LMWCS可以明显改善侧脑室注射Ap1-40所致AD小鼠的学习记忆功能。学习记忆测试结束后,小鼠经断头处死,剥离大脑海马和皮层区,采用比色法测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、Na+/K+-ATP酶活力及丙二醛(MDA)含量,测定胆碱乙酰化转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶(AC hE)活性。结果表明,LMWCS可以明显提高Aβ1-40所致AD小鼠海马和皮层区中抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性,以及Na+/K+-ATP酶、Ch AT的活性,降低了MDA的含量和AChE的活性,提示LMWCS可以改变Aβ1-40所致AD小鼠脑内氧化应激水平,维持小鼠脑内能量代谢的稳定性,改善了小鼠大脑中海马和皮层区的胆碱能系统功能。小鼠大脑切片进行HE染色后发现海马区组织形态学改变,Aβ1-40可导致脑组织海马CA1区神经元出现损伤,而给予LMWCS后神经元的损伤情况改善。免疫组化结果显示,Aβ1-40能够增加小鼠大脑海马CA1区Caspase-9、弓的活性。而L MWCS可以降低Caspase-9、-3的表达,使其阳性细胞数量减少,起到抗凋亡的作用。Western blot结果显示,LMWCS在凋亡过程中表现出了抗凋亡作用,可激活凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,抑制在小鼠细胞凋亡中起关键作用的Bax、Caspase-9、-3蛋白表达,最终起到了降低了细胞凋亡的作用。LMWCS的作用机制可能与降低Aβ神经毒性作用,抑制神经元的凋亡等有关,可能在治疗AD的作用中具有一定的作用。综上所述,本研究第一次在体外和体内实验中评价LMWCS对Ap诱导产生的细胞凋亡具有保护作用。LMWCS具有对Ap所致AD模型的保护作用,可有效抑制Aβ25-35诱导产生的PC12细胞和SH-SY5Y细胞的毒性作用,拮抗细胞内游离Ca2+浓度的升高、自由基的产生和聚集、线粒体的功能障碍,还可以降低凋亡促进蛋白Bax和Caspase-9、-3蛋白表达的升高,激活凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,最终抑制Aβ25-35所引起的神经细胞凋亡。与此同时,LMWCS在体内实验中表现出明显改善Aβ1-40所致模型小鼠学习记忆障碍的作用,并能提高模型小鼠大脑内海马和皮层区SOD、GSH-Px的活力水平,清除过氧化产物,降低MDA的含量,从而改善小鼠大脑内氧化和抗氧化的紊乱状态,保护能量代谢关键酶Na+/K+-ATP酶免受氧化损伤,进而维持脑内能量代谢的稳定,还能通过促进中枢胆碱能系统乙酰胆碱(ACh)的合成而改善胆碱能系统功能,起到保护小鼠大脑的作用。因此,LMWCS可以用于预防或治疗Ap诱导产生的神经毒性,能够作为一种抗AD的候选活性成分,用于制备治疗、改善或预防认知功能衰退相关的神经系统疾病的药物。
【关键词】：低分子量硫酸软骨素(LMWCS) 淀粉样蛋白β(Aβ) 神经保护 阿尔茨海默病(AD)
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 中文摘要11-15
• Abstract15-19
• 缩略语说明19-22
• 第一章 前言22-41
• 1 AD研究现状22-24
• 2 AD发病机制的研究24-29
• 3 AD模型的制备29-32
• 4 AD的治疗32-35
• 5 糖类及其衍生物抗AD研究概况35-39
• 6 本课题拟解决的问题和意义39-41
• 第二章 LMWCS对Aβ诱导的神经细胞损伤的保护作用及机制探讨41-71
• 1 实验材料41-45
• 1.1 药品及试剂41-42
• 1.2 仪器及耗材42-44
• 1.3 工作溶液的配制44-45
• 1.4 细胞45
• 2 实验方法45-52
• 2.1 LMWCS的制备及分析45-46
• 2.2 细胞活力测定46-47
• 2.3 细胞凋亡测定47
• 2.4 游离钙离子浓度测定47
• 2.5 ROS测定47-48
• 2.6 细胞内氧化应激及能量代谢水平测定48-49
• 2.7 MMP测定49
• 2.8 Caspase-3酶测定49-50
• 2.9 总蛋白的提取及定量50-51
• 2.10 Western blot分析51
• 2.11 统计学处理51-52
• 3 实验结果52-67
• 3.1 LMWCS的制备52-54
• 3.2 LMWCS对Aβ25-35诱导的神经细胞损伤的保护作用54-57
• 3.3 LMWCS对Aβ25-35引起细胞凋亡的影响57
• 3.4 LMWCS对Aβ25-35引起细胞内游离钙离子浓度变化的影响57-59
• 3.5 LMWCS对Aβ25-35引起细胞内ROS变化的影响59-60
• 3.6 LMWCS对Aβ25-35引起细胞内氧化应激水平变化的影响60-63
• 3.7 LMWCS对Aβ25-35引起的MMP变化的影响63
• 3.8 LMWCS对Aβ25-35诱导细胞表达Caspase-3变化的影响63-65
• 3.9 LMWCS对Aβ25-35诱导细胞凋亡相关蛋白表达量变化的影响65-67
• 4 讨论67-70
• 5 小结70-71
• 第三章 LMWCS对Aβ诱导小鼠脑损伤的保护作用及机制的研究71-97
• 1 实验材料71-72
• 1.1 药品及试剂71
• 1.2 仪器71
• 1.3 工作溶液的配制71-72
• 1.4 动物来源72
• 2 实验方法72-79
• 2.1 动物分组和给药方法72-73
• 2.2 模型制作73
• 2.3 行为学检测73-74
• 2.4 小鼠大脑海马和皮层区氧化应激及能量代谢水平的测定74
• 2.5 小鼠大脑海马和皮层区胆碱能功能测定74-75
• 2.6 免疫组织化学75-78
• 2.7 总蛋白的提取及定量78
• 2.8 Western blot分析78
• 2.9 实验结果统计78-79
• 3 实验结果79-91
• 3.1 LMWCS对Aβ模型小鼠学习记忆能力变化的影响79-82
• 3.2 LMWCS对Aβ模型小鼠脑组织氧化应激水平变化的影响82-86
• 3.3 LMWCS对Aβ模型小鼠大脑中胆碱酯酶活性变化的影响86-87
• 3.4 免疫组化结果87-90
• 3.5 Western blot结果90-91
• 4 讨论91-96
• 5 小结96-97
• 总结与展望97-99
• 1 论文主要结论97-98
• 2 论文创新点98
• 3 论文的不足之处98
• 4 展望98-99
• 参考文献99-114
• 致谢114-115
• 博士期间发表的论文115-116
• 论文116-130
• 附件130

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 陈惠黎;;糖生物学是研究生命现象的第三个里程碑——糖生物学专刊序言[J];生命科学;2011年06期

2 胡金凤,耿美玉;老年斑、神经元纤维缠结与硫酸多糖[J];中国药理学通报;2003年01期

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本文编号：829386