抑郁症研究：体液氨基酸测定和雌激素膜受体调控CRH表达

发布时间：2017-09-12 18:34

  本文关键词：抑郁症研究：体液氨基酸测定和雌激素膜受体调控CRH表达

  更多相关文章： 氨基酸 脑脊液 高效液相色谱法 柱前衍生化 重性抑郁障碍 双向情感障碍 雌激素 膜受体 促肾上腺皮质激素释放激素 一氧化氮 一氧化氮合酶

【摘要】：第一部分改良反相高效液相色谱-荧光检测法测定情感障碍患者脑脊液和血浆内游离氨基酸水平背景:体液中的氨基酸(amino acid,AA)类神经递质如谷氨酸(glutamic acid,Glu)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)的含量变化有可能成为情感障碍临床诊断的生物学标志。研究者经常选用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定体液内神经活性物质包括氨基酸类物质。离子交换型HPLC(IE-HPLC)在测定低水平游离AA时存在着样本分离时间较长、不能同时分离多种AA,以及样品中许多AA水平低于仪器的检测限等缺陷。反相HPLC(RP-HPLC)偶联高端检测仪器(例如质谱仪)则能显著提高检测的灵敏度。但是,由于质谱仪贵重且需要专业技术人员操作,难以便利地运用到相关临床研究中去。RP-HPLC-荧光检测(FLD)(RP-HPLC-FLD)具有分辨率强、以水相作为流动相的基本组分之一、色谱柱易于平衡等特点被受到广泛应用。但是RP-HPLC-FLD法在测定体液中的氨基酸时也存在着一些不易自动化衍生、分离时间较长以及检测限偏高等不足。因此,我们在本研究中首先基于一项测定大鼠脑组织中Glu、GABA和组胺含量的RP-HPLC程序(在本文中被称为"常规方法")对HPLC的工作条件进行一系列改良,建立了一种稳定而灵敏的适用于较大规模情感障碍患者脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)、血浆等体液中低水平游离AA水平测定的RP-HPLC-FLD方案。我们采用这种方案研究了情感障碍患者(包括重性抑郁障碍(major depressive disorder,MDD)和双向情感障碍(bipolar depression,BD))死亡后脑室CSF中Glu和GABA含量变化特征。方法:针对常规方法,我们主要对RP-HPLC的三方面步骤进行了改进:i)在AA标品或的样品制备(包括除蛋白)阶段,采用硼酸缓冲液代替高氯酸溶解AA标准品或者CSF样品,采用甲醇代替高氯酸去除CSF样品中的蛋白质;ii)在衍生化反应阶段,采用使衍生化反应更加稳定的邻苯二甲醛(O-phthaldialdehyde,OPA)-疏基丙酸代替OPA-Thiofluor;iii)在样品的分离时,采用不含乙腈的醋酸盐缓冲液并添加三乙胺和四氢呋喃的流动相,可以消除拖尾峰和重叠峰,且保持长时间连续测定。采用改良的RP-HPLC-FLD方法分离情感障碍患者CSF和血浆中的氨基酸;采用该改良RP-HPLC-FLD方法测定17例抑郁症患者,包括8例MDD和9例BD以及19例完好匹配的对照者死亡后CSF-Glu和CSF-GABA的含量。结果:采用优化的RP-HPLC-FLD方法在40分钟内获得23种AA标准品的最佳分离。对来自临床的初次诊断未用药临床忧郁型MDD患者的血浆和CSF以及对抑郁症患者死亡后CSF进行23种游离AA的测定,同样获得窄(特异)而高的信号峰。以CSF-Glu和-GABA为例,改良方法的质控参数为最低检测限分别是1pg/μL和0.5pg/μL、最低定量限分别是3.68pg/μL和1.03pg/μL、回收率分别是102.71%和 104.41%、日内差是(1.99-3.82)%和日间差是(3.26-7.83)%。MDD患者CSF-Glu和CSF-GABA的含量显著低于对照组(P≤0.0209),而BD组与对照组相比没有显著变化(P≥0.4030);MDD组的CSF-Glu和CSF-GABA也显著低于 BD 组(两者 P=0.0056)。在对照组内,CSF-Glu(rho=0.826,P=0.000)和 CSF-GABA(rho=0.887,P=0.000)水平均与死后延搁时间(postmortem delay,PMD)呈显著正相关;CFS-GABA(rho=-0.567,P=0.011)与年龄呈显著负相关。CSF-Glu和GABA在对照组未发现显著性别差异(P≥0.422)。结论:优化的RP-HPLC-FLD法适用于检测情感障碍患者体液中低游离AA水平,低水平CSF-Glu和CSF-GABA可能是MDD的临床特征,并可能用于与BD的鉴别诊断。第二部分雌激素膜受体-NO通路对CRH表达的调控机制研究背景:抑郁症在女性高发,WHO已将它列为女性健康的头号威胁。育龄期女性抑郁症发病率是男性的两倍。体内应激反应关键调节系统下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴活性过度亢进被推测是抑郁症临床症候群的神经生物学重要发病机制。我们和其他研究组的研究已经发现,雌激素作为核转录因子刺激下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)因而刺激HPA轴活性,为雌激素参与抑郁症发病机制提供了重要依据。值得注意的是,雌激素除了经典的核受体调节途径,还可以与其膜受体结合而引发下游信号级联反应,影响靶基因转录,也即具有非基因组调节方式。脑内多种分子参与了雌激素的这类调节通路,例如气体性神经调质一氧化氮(NO)不仅在抑郁症发病中扮演重要角色,还有证据显示雌激素-NO通路参与应激反应调节。本部分研究旨在阐明雌激素与其膜受体结合后,如何调控CRH的释放及其基因表达以及一氧化氮合酶(NOS)-NO通路在这种调控机制中的作用。方法:1)在内源性表达CRH、雌激素受体α(ERα)、雌激素受体β(ERβ)、G蛋白偶联受体30(GPR30)、神经元型一氧化氮合酶(NOS1)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)和内皮型一氧化氮合酶(NOS3)的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞系,采用不同浓度E2-BSA(一种结合BSA的雌激素,仅与细胞膜上的雌激素受体结合,不能进入细胞内)或E2-BSA不同时间刺激SK-N-SH细胞,观察细胞内NO的含量变化、细胞培养液内CRH的释放变化、CRH-mRNA以及ERs和NOS的mRNA表达水平的变化;采用SNP(NO供体)、或采用7-Ni(NOS1的特异性抑制剂)联合E2-BSA作用于SK-N-SH细胞,检测细胞内NO的含量变化、细胞培养液内CRH的含量、CRH-mRNA以及ERs和NOS的mRNA表达水平。此外,本研究还比较E2-BSA与E2刺激SK-N-SH细胞所引起CRH mRNA表达水平改变特征;2)将含人CRH基因启动子的荧光素酶报告基因质粒瞬时转染入HEK293T细胞,24小时后采用E2-BSA刺激细胞,于0分钟、30分钟和24小时的时间点,采用双荧光素酶检测试剂检测人CRH启动子的活性。结果:E2-BSA增加SK-N-SH细胞内NO含量,于0.5小时显著刺激细胞释放CRH,于24小时显著增加CRH-mRNA表达水平。SNP显著刺激SK-N-SH细胞释放CRH,增加CRH-mRNA表达水平。7-Ni抑制E2-BSA对SK-N-SH细胞内NO、CRH释放和CRH-mRNA的刺激作用。E2-BSA在无NOS1的条件下可以上调人CRH启动子活性。结论:E2-BSA与SK-N-SH细胞的膜受体结合,上调细胞内NO表达,刺激CRH的释放并促进CRH-mRNA表达;NOS1-NO并非唯一的通路参与雌激素通过其膜受体刺激CRH活性的调控机制。
【关键词】：氨基酸 脑脊液 高效液相色谱法 柱前衍生化 重性抑郁障碍 双向情感障碍 雌激素 膜受体 促肾上腺皮质激素释放激素 一氧化氮 一氧化氮合酶
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.4
【目录】：

• 致谢5-6
• 序言6-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-18
• 缩略语18-24
• 第一部分 改良反相高效液相色谱法测定情感障碍患者脑脊液和血浆内游离氨基酸水平24-49
• 1.1 引言24-27
• 1.2 材料与方法27-33
• 1.2.1 主要试剂与仪器设备27-28
• 1.2.1.1 试剂27
• 1.2.1.2 仪器设备27-28
• 1.2.1.3 CSF和血浆样品28
• 1.2.2 样品制备和HPLC工作条件28-32
• 1.2.2.1 常规方法28-29
• 1.2.2.2 改良方法29-32
• 1.2.2.3 其他HPLC条件32
• 1.2.3 统计分析32-33
• 1.3 结果33-43
• 1.3.1 采用常规方法对CSF中游离氨基酸的分离结果33
• 1.3.2 改良方法对23种游离氨基酸的分离结果33-38
• 1.3.3 抑郁症患者死亡后CSF中Glu和GABA的变化38-43
• 1.3.3.1 改良方法的质控参数38-39
• 1.3.3.2 CSF中Glu和GABA的变化39-43
• 1.4 讨论43-48
• 1.5 结论48-49
• 第二部分 雌激素膜受体— NO通路对CRH表达的调控机制研究49-81
• 2.1 引言49-53
• 2.2 材料与方法53-61
• 2.2.1 主要试剂和仪器设备53-54
• 2.2.1.1 主要试剂53-54
• 2.2.1.2 主要仪器设备54
• 2.2.2 实验方法54-60
• 2.2.2.1 细胞培养54-55
• 2.2.2.2 荧光免疫细胞化学55-56
• 2.2.2.3 引物设计56
• 2.2.2.4 细胞内mRNA的Q-PCR分析56-58
• 2.2.2.5 荧光探针法测定细胞内NO含量58
• 2.2.2.6 EIA法测定细胞培养液内CRH的含量58-59
• 2.2.2.7 转染实验59
• 2.2.2.8 双荧光素酶检测方法59-60
• 2.2.2.9 去除E2-BSA试剂中的游离E260
• 2.2.3 统计分析60-61
• 2.3 结果61-76
• 2.3.1 SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞的特征61-64
• 2.3.1.1 SK-N-SH细胞生长形态61
• 2.3.1.2 Q-PCR法检测SK-N-SH细胞表达的基因61-63
• 2.3.1.3 荧光免疫细胞化学法检测SK-N-SH细胞的CRH和ERs表达63-64
• 2.3.2 E2-BSA对SK-N-SH细胞内NO含量的影响64-66
• 2.3.3 E2-BSA对SK-N-SH细胞内CRH释放以及CRH、ERs和NOS基因mRNA表达的影响66-69
• 2.3.3.1 E2-BSA对SK-N-SH细胞CRH释放的影响66
• 2.3.3.2 E2-BSA对CRH、ERs和NOS基因的mRNA表达的影响66-69
• 2.3.4 SNP对SK-N-SH细胞内CRH释放以及CRH、ERs和NOS基因mRNA表达的影响69-72
• 2.3.4.1 SNP对SK-N-SH细胞CRH释放的影响69
• 2.3.4.2 SNP对SK-N-SH细胞CRH、ERs和NOS mRNA表达的影响69-72
• 2.3.5 7-Ni对SK-N-SH细胞内NO和CRH的作用72-74
• 2.3.5.1 7-Ni对SK-N-SH细胞内NO的作用72
• 2.3.5.2 7-Ni对SK-N-SH细胞释放CRH的作用72-73
• 2.3.5.3 7-Ni对SK-N-SH细胞CRH mRNA的作用73-74
• 2.3.6 HEKA293T细胞转染及E2-BSA对人CRH基因启动子活性的作用效应74-76
• 2.3.6.1 HEK293T细胞中CRH、ERs和NOS的检测74
• 2.3.6.2 E2-BSA对人CRH基因启动子活性的作用74-76
• 2.4 讨论76-80
• 2.4.1 E2-BSA对NOS-NO和CRH的作用76-77
• 2.4.2 NO对CRH释放和基因表达的作用77-78
• 2.4.3 E2-BSA对ERs的作用78-79
• 2.4.4 E2-BSA刺激人CRH基因启动子活性79-80
• 2.5 结论80-81
• 参考文献81-95
• 总体讨论和展望95-97
• 综述 高效液相色谱法—测定体液（脑脊液）中氨基酸和组胺含量97-118
• 参考文献110-118
• 附录一 抑郁症患者和对照者临床病理学信息118-119
• 附录二 引物序列119-120
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果120-121

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李曦,李艳红,陈晓兰;30例抑郁症患者的P_(300)电位研究[J];健康心理学杂志;2000年03期

2 艾丽,秦晓霞;抑郁症与自杀问题[J];中国乡村医生;2000年03期

3 卢胜利;光量子氧透射治疗抑郁症的对照研究[J];现代康复;2000年06期

4 孔淑华;青春期抑郁症的防治效果分析[J];中国校医;2000年06期

5 万艳琼,谢斌,郑瞻培;抑郁症患者1年内再次住院的相关因素分析[J];上海精神医学;2000年03期

6 赵庆莲,李莲芳,王立伟,诸索宇;血管性因素在抑郁症发病中的作用[J];上海精神医学;2000年03期

7 闫立新,韦好儒,陈林庆;以反复呃逆为首发症状的抑郁症一例[J];中华精神科杂志;2001年01期

8 郁缪宇;抑郁症的神经营养机制[J];国外医学.精神病学分册;2001年04期

9 李银霞,张淑兰,林桂梅;抑郁症患者的心理问题及康复指导[J];现代康复;2001年11期

10 张然;让抑郁症无处藏身[J];中国工商;2001年10期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 赵海京;李跃华;杨慧敏;肖爽;;抑郁症相关因素的归因分析[A];中国中西医结合学会养生学与康复医学专业委员会委员会议暨第七次学术研讨会论文集[C];2011年

2 范振国;;青少年抑郁症的咨询与分析[A];中国心理卫生协会青少年心理卫生专业委员会第八届全国学术会议论文集[C];2002年

3 周东丰;孙学礼;张心保;赵贵芳;马崔;许毅;欧红霞;李惠春;李斌彬;;噻奈普汀与氟西汀治疗抑郁症疗效与安全性的多中心开放研究[A];中国神经科学学会精神神经专业委员会成立大会暨第一届学术会议论文集[C];2004年

4 邹春玲;;96例老年住院荣军抑郁症调查[A];中国民政康复医学第四届学术会议论文集[C];1993年

5 魏道敏;汪厚根;;抑郁症与自杀关系的探讨[A];湖北省民政康复医学会第六届学术会议论文集[C];1998年

6 耿峰;李晓驷;郑东旭;周晓琴;谢雯;季益富;夏海涛;;抑郁症患者早年分离经历调查研究[A];中华医学会第十次全国精神医学学术会议论文汇编[C];2012年

7 周翠粉;王世伟;;青少年抑郁症的诱发因素及防治[A];精神科护理风险管理培训班及学术交流会论文集[C];2012年

8 王培;;就诊于口腔科的抑郁症12例临床分析[A];中华口腔医学会全科口腔医学专业委员会第一次学术年会会议论文集[C];2009年

9 芮晓东;;老年人首发抑郁症头颅影像学分析[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年

10 ;关于建立抑郁症科学防治体系的几点建议[A];2010中国科协科技工作者建议汇编[C];2010年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 本报记者 张新德;知识分子高发抑郁症[N];长春日报;2005年

2 彭怀仁;归属感与抑郁症[N];光明日报;2000年

3 本报记者 罗序文 实习生 周新宇;不可忽视的抑郁症[N];湖北日报;2005年

4 本报记者 非尔;抑郁症“盯上”白领丽人[N];华夏时报;2004年

5 绿水;抑郁症与全身疾病[N];卫生与生活报;2003年

6 吕斌;关注男性抑郁症[N];中国医药报;2005年

7 广东 廖祖笙;给抑郁症患者真正的出路[N];中国信息报;2005年

8 陈福新;抑郁症青睐5种人[N];中国中医药报;2005年

9 刘共;话语太多可能是抑郁症[N];大众卫生报;2007年

10 唐艳英;更年期情绪低落警惕抑郁症[N];大众卫生报;2007年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 刘志芬;抑郁症外周血特异lncRNAs的筛选与验证[D];山西医科大学;2015年

2 米国琳;HTR3A基因多态性与抑郁症及其临床表型的关联研究[D];山东大学;2015年

3 赵约翰;银杏叶提取物EGb761改善脂多糖诱导的小鼠抑郁样行为及其机制研究[D];山东大学;2015年

4 钟静玫;替普瑞酮抵抗环境应激所致抑郁的作用机制研究[D];昆明理工大学;2015年

5 曲姗姗;电针印堂、百会治疗轻中度原发性抑郁症的临床观察及Rs-fMRI研究[D];南方医科大学;2015年

6 王凯明;抑郁症脑电信号的非线性研究与诊断模型构建[D];北京工业大学;2015年

7 魏强;抑郁症电抽搐治疗的静息态功能磁共振成像研究[D];安徽医科大学;2015年

8 陈玉明;抑郁症患者的负性认知偏向[D];湖南师范大学;2015年

9 刘佳佳;KIBRA基因多态性、社会心理因素及端粒在抑郁症中的研究[D];山东大学;2015年

10 张永东;银杏叶提取物EGb761抑制NF-κB-IL-6信号通路缓解长期避光诱发的小鼠抑郁样行为[D];山东大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 王翠;媒介真实与现实世界的背离：国内报纸抑郁症患者形象再现研究[D];安徽大学;2010年

2 马洋洋;抑郁症的中西医研究进展[D];北京中医药大学;2011年

3 隋丽娜;哈尔滨地区抑郁症患者就诊行为的社会心理因素分析[D];黑龙江中医药大学;2012年

4 刘欢欢;首发青少年抑郁症患者静息态功能磁共振的研究[D];郑州大学;2015年

5 王闪闪;抑郁症患者发病进程中神经机制的探索[D];西南大学;2015年

6 刘瑞凌;高频重复经颅磁刺激治疗抑郁症患者的临床研究[D];安徽医科大学;2015年

7 张洁;巴戟天寡糖胶囊治疗抑郁症的临床研究[D];山西医科大学;2015年

8 郭冰心;抑郁症患者对情绪面孔的定向遗忘效应[D];安徽医科大学;2015年

9 杨欢;柴胡加龙骨牡蛎汤治疗气郁化火型抑郁症疗效观察及其对HPA轴的影响[D];甘肃中医药大学(原名：甘肃中医学院);2015年

10 郑郭Z，

本文编号：838863