蜂王浆多肽的制备及其对神经细胞保护作用的研究

发布时间：2017-09-13 19:16

  本文关键词：蜂王浆多肽的制备及其对神经细胞保护作用的研究

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【摘要】：阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种以β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)级联假说为主要病因的老年神经退行性疾病。蜂王浆对神经细胞具有营养和促进细胞分化的作用。主要王浆蛋白1(MRJP1)是主要王浆蛋白家族中含量最高的成员,《Nature》报道指出MRJP1是蜜蜂幼虫发育成为蜂王的关键因子。主要王浆蛋白酶解后的蜂王浆多肽(Royal Jelly Peptides,RJP)具有极强的抗氧化和抗衰老的能力。本论文以主要王浆蛋白的主要成分MRJP1为研究目标,探索了主要王浆蛋白1(MRJP1)的分离纯化方法,而且首次使用胰蛋白酶酶解主要王浆蛋白1(MRJP1),并以AD的两种经典细胞模型为筛选活性多肽的依据,对具有活性的蜂王浆多肽进行质谱鉴定。结果如下:首先,本论文以新鲜的蜂王浆为原材料,按一定的比例将蜂王浆与磷酸盐缓冲液混合,抽提水溶性蜂王浆蛋白,利用Ni柱亲和层析、阴离子交换层析等蛋白纯化技术从天然的蜂王浆中分离纯化得到MRJP1样品,经过串联质谱技术鉴定该样品为MRJP1。其次,分离纯化得到的MRJP1与胰蛋白酶按质量比2:1的比例进行酶解反应,所得酶解产物,经过超滤管超滤,以及反相高压液相色谱分离制备蜂王浆多肽样品。再次,以AD的两种经典细胞模型人神经瘤母细胞SH-SY5Y及小鼠神经瘤母细胞N2a/APP695sw作为筛选活性多肽的依据。经过对多肽样品进行SH-SY5Y细胞的MTT细胞毒性试验以及N2a/APP695sw细胞的AβELISA检测,发现分子量0-3 kDa的RJP和RP-HPLC得到的C组RJP对细胞具有显著地保护作用,而且浓度为114.6μg/ml的分子量0-3 kDa的RJP和浓度为11.1μg/ml的C组RJP对细胞具有较高的药理活性。最后,采用高性能液质联用质谱技术对具有显著药理活性的C组RJP进行多肽组成及寡肽的氨基酸序列分析。质谱结果显示,其多肽组成较复杂。使用mascot软件检索ncbi_insecta数据库,匹配到三条寡肽,并得到其氨基酸序列及分子量信息。本研究首次以在蜂王幼虫的发育过程中起关键作用的MRJP1为研究目标,探索其胰蛋白酶酶解产物蜂王浆多肽对AD的药用价值。通过对AD的两种细胞模型的保护作用研究显示,具有药理活性的RJP来源于MRJP1。利用高性能液质联用质谱技术对具有药理活性的RJP进行结构的初步分析,为研制具有预防和治疗AD功能的天然药物提供物质基础和理论依据。
【关键词】：主要王浆蛋白1 蜂王浆多肽 阿尔兹海默症 反相高压液相色谱 液质联用质谱技术
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一章 综述10-21
• 1 主要王浆蛋白及多肽的简介10-14
• 1.1 水溶性主要王浆蛋白MRJPs家族概述10
• 1.2 主要王浆蛋白家族成员的研究概况10-12
• 1.3 MRJPs的生物学功能12-13
• 1.4 蜂王浆多肽的生物学功能13-14
• 2 主要王浆蛋白及多肽的分离纯化的研究现状14-16
• 2.1 MRJPs的分离纯化14-15
• 2.2 多肽类的分离15-16
• 2.3 蛋白质及多肽的质谱鉴定16
• 3 阿尔兹海默症发病机制的研究进展16-18
• 3.1 阿尔兹海默症的简介16-17
• 3.2 β 淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）级联假说17
• 3.3 用于研究AD的细胞模型17-18
• 3.4 阿尔兹海默症的治疗现状18
• 4 主要王浆蛋白治疗阿尔兹海默症的潜力18-19
• 4.1 蜂王浆对神经细胞具有神经营养和促进分化的作用18-19
• 4.2 蜂王浆对阿尔兹海默症有较好的防治和缓解作用19
• 5 本论文的研究内容及目的意义19-21
• 第二章 蜂王浆混合多肽的制备21-34
• 1 材料与方法21-27
• 1.1 材料21-22
• 1.2 仪器22
• 1.3 方法22-27
• 1.3.1 水溶性主要王浆蛋白（WSRJ）溶液的制备22-23
• 1.3.2 主要王浆蛋白MRJP1的亲和层析23-24
• 1.3.3 主要王浆蛋白MRJP1的离子交换层析24-25
• 1.3.4 主要王浆蛋白MRJP1的LC-MS/MS质谱鉴定25
• 1.3.5 主要王浆蛋白MRJP1的胰蛋白酶酶解25-26
• 1.3.6 分子量为 0-3 kDa的蜂王浆混合多肽的分离制备26
• 1.3.7 分子量为 0-3 kDa蜂王浆混合多肽的四个组份的制备26-27
• 2 结果与分析27-32
• 2.1 主要王浆蛋白MRJP1亲和层析结果27-28
• 2.2 主要王浆蛋白MRJP1的离子交换层析结果28-29
• 2.3 主要王浆蛋白MRJP1的LC-MS/MS质谱鉴定29
• 2.4 蜂王浆MRJP1的胰蛋白酶酶解结果29-30
• 2.5 混合多肽组份的分析制备30-32
• 3 讨论32-34
• 第三章 有效成份的细胞活性检测及结构的初步分析34-47
• 1 材料与方法34-38
• 1.1 材料34
• 1.2 仪器34-35
• 1.3 方法35-38
• 1.3.1 MTT法测定RJP对SH-SY5Y细胞的保护作用35
• 1.3.2 Aβ ELISA测定RJP对N2a/APP695sw细胞的保护作用35-37
• 1.3.3 Q-Exactrve LC-MS/MS对寡肽的分子量及氨基酸序列分析37-38
• 1.3.4 统计学方法38
• 2 结果与分析38-44
• 2.1 MTT法测定RJP对SH-SY5Y细胞的保护作用38-41
• 2.2 细胞形态学观察RJP对诱导损伤的SH-SY5Y细胞的作用41-42
• 2.3 Aβ ELISA测定RJP对N2a/APP695sw细胞的保护作用42-43
• 2.4 Q-Exactrve LC-MS/MS对寡肽的分子量及氨基酸序列分析43-44
• 3 讨论44-47
• 第四章 全文总结47-49
• 参考文献49-55
• 附录1 图表目录55-56
• 附录2 英文缩写说明56-57
• 附录3 RJP的质谱数据57-58
• 致谢58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：845406