药物成瘾候选基因的DNA甲基化研究

发布时间：2017-09-25 20:15

  本文关键词：药物成瘾候选基因的DNA甲基化研究

  更多相关文章： 药物成瘾 DNA甲基化 BDNF DRD4 OPRK1

【摘要】：目的:本研究测定病例对照中药物成瘾易感基因的DNA甲基化水平,探究DNA甲基化水平与药物成瘾的关系。并验证所检测区域的DNA甲基化是否会引起表达量的改变。方法:收集确诊的药物成瘾患者60例和健康对照52例,利用焦磷酸测序法对BDNF、DRD4和OPRK1基因的启动子区域CGI进行DNA甲基化水平测定。并与患者的POMS问卷结果进行关联性分析。借助双荧光素酶报告系统检测DNA甲基化水平测定区域对表达的影响,通过5’AZA去甲基化处理,检测测定区域的DNA甲基化改变对表达的影响。结果:(1)海洛因成瘾对精神情绪状态上的影响比甲基苯丙胺更大。尤其是愤怒-敌意评分(P=0.010),抑郁-沮丧评分(P=0.033),有力-好动评分(P=0.001)和困惑-迷茫评分(P=0.001);(2)病例对照研究:药物成瘾组BDNF CpG1-CpG4高甲基化,而CpG5低甲基化(P=0.002);DRD4启动子CpG1(P=0.009)、CpG4(P=0.009)和CpG7(P=0.003)高甲基化,OPRK1启动子Cp G2-Cp G7呈现低甲基化(P0.05);(3)甲基苯丙胺组BDNF CpG3甲基化水平高于海洛因组(P=0.024),而其他位点均没有显著差异(P0.05);(4)BDNF CpG5的甲基化水平都分别与抑郁-沮丧评分(P=0.018),疲惫-惰性评分(P=0.016),愤怒-敌意评分(P=0.036)和紧张-焦虑评分(P=0.010)呈负相关,而DRD4 CpG6的甲基化水平与药物成瘾患者的迫切性评分有负相关性(P=0.017)。亚组分析发现,海洛因组中BDNF Cp G5甲基化水平与疲惫-惰性评分负相关(P=0.032);DRD4 CpG5甲基化水平与抑郁-沮丧评分正相关(P=0.002),OPRK1 CpG2甲基化水平与疲惫-惰性平分负相关(P=0.020);(5)BDNF检测区域片段缺失会引起表达下调(P=0.019),OPRK1检测区域片段缺失会引起表达上调(P=0.013),而DRD4检测区域片段缺失,基因表达严重受阻(P=0.000002);(6)BDNF检测区域片段去甲基化后引起表达下调(P=0.008),OPRK1检测区域片段去甲基化后表达上调(P=0.044)。结论:病例对照研究:BDNF CpG5低甲基化;DRD4启动子CpG1、CpG4和CpG7高甲基化,OPRK1启动子CpG2-CpG7呈现低甲基化与药物成瘾患病风险有关。而BDNF CpG3甲基化水平可用于评价海洛因成瘾与甲基苯丙胺成瘾之间的差异;在四类情绪状态评分上(愤怒-敌意评分,抑郁-沮丧评分,有力-好动评分和困惑-迷茫评分),海洛因组的影响都比甲基苯丙胺更大;BDNF,DRD4和OPRK1三个基因的甲基化水平与不同的情绪状态有关。所测定的区域都与基因表达量有关联,BDNF检测区域片段缺失会引起表达下调,OPRK1检测区域片段缺失会引起表达上调,而DRD4检测区域片段缺失,基因表达严重受阻;BDNF测定区域去甲基化后引起表达下调,OPRK1检测区域片段去甲基化后表达上调。
【关键词】：药物成瘾 DNA甲基化 BDNF DRD4 OPRK1
【学位授予单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.6
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-12
• 1 目的12
• 2 实验材料与方法12-25
• 2.1 实验仪器12
• 2.2 主要试剂12-14
• 2.2.1 部分试剂配制13-14
• 2.3 人群样本的甲基化水平测定14-18
• 2.3.1 候选基因的挑选14
• 2.3.2 引物设计14
• 2.3.3 实验对象14-15
• 2.3.4 外周血全基因组DNA的提取15-16
• 2.3.5 亚硫酸氢盐处理16
• 2.3.6 PCR反应16-17
• 2.3.7 焦磷酸测序17-18
• 2.4 重组质粒的构建18-22
• 2.4.1 引物设计18-19
• 2.4.2 目标片段的PCR扩增19-20
• 2.4.3 pGL3质粒提取20
• 2.4.4 PCR片段和pGL3粘性末端的获得20-21
• 2.4.5 PCR片段和pGL3连接21-22
• 2.4.6 转化产物的鉴定22
• 2.5 293细胞培养和重组质粒转染22-24
• 2.5.1 293细胞复苏22
• 2.5.2 细胞传代22-23
• 2.5.3 细胞冻存23
• 2.5.4 提取去内毒素的重组质粒23
• 2.5.5 细胞种板和脂质体转染23
• 2.5.6 脂质体转染23-24
• 2.5.7 双荧光素酶报告系统检测24
• 2.5.8 5’AZA处理24
• 2.6 数据统计分析24-25
• 3 结果25-39
• 3.1 临床资料比较和各基因检测的CpG位点信息25-27
• 3.2 药物成瘾组与健康对照组甲基化水平比较27-30
• 3.3 海洛因组和甲基苯丙胺组甲基化水平比较和POMS评分关联性分析30-33
• 3.4 重组质粒的构建33-36
• 3.5 检测目的片段对基因表达的影响36-37
• 3.6 5’AZA对检测目的片段基因表达的影响37-39
• 4 讨论39-42
• 参考文献42-46
• 附录A 部分中英文对照表46-47
• 附录B 综述47-66
• 参考文献58-66
• 在学研究成果66-67
• 致谢67

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本文编号：919356