发作性运动诱发性运动障碍PRRT2突变特征，基因型表型关系及可能机制

发布时间：2017-10-01 15:00

  本文关键词：发作性运动诱发性运动障碍PRRT2突变特征，基因型表型关系及可能机制

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【摘要】：发作性运动诱发性运动障碍(paroxysmal kinesigenic dyskinesia, PKD)是发作性运动障碍中最常见的一种,临床表现为反复发作,运动诱发,持续时间短暂的非随意运动,如舞蹈征、手足徐动征、投掷症、肌张力障碍等。PKD分家族性和散发性,其中家族性PKD呈常染色体显性遗传。PKD患者男性明显多于女性,男女比例约为3-4：1。本病一般在儿童期或青春前期起病,30岁后症状多自发缓解或完全消失。发作频率每天数次至数十次,最多可高达一百多次。我们前期研究发现PRRT2为PKD的致病基因,并得到国内外研究小组的证实。然而目前尚不清楚散发性PKD是否也携带PRRT2基因突变,PRRT2基因型是否与PKD临床表型存在关系,另外PRRT2突变导致PKD的分子机制是什么也不明确。因此我们拟在前期研究基础上进一步探讨PKD患者中PRRT2基因突变特征,PKD基因型-表型间关系,并初步探讨PKD的发病机制。第一部分发作性运动诱发性运动障碍散发病例PRRT2基因突变的特征目的：探讨散发性PKD患者中PRRT2基因突变特征方法：共收集41例散发性PKD患者,抽取静脉血3 mL,标准法提取DNA,Sanger法测PRRT2基因序列,PRRT2阴性者进一步筛查MR1,SLC2A1,CLCN1基因。选取18个SNPs进行单体型分析。结果：41例散发性PKD中有7例携带PRRT2突变,其中5例携带c.649dupC,1例携带c.649delC,1例携带c.133_136de1CCAG。进一步筛查父母的PRRT2基因,5例患者父亲或母亲一方携带PRRT2突变,2例患者父母均无突变。34例PRRT2阴性的PKD患者中有1例携带SLC2A1基因c.363GA突变,2例携带CLCN1基因c.1205CT突变。单体型分析证实了家系的血缘关系。结论：散发性PKD患者携带PRRT2基因突变的比率较低；PRRT2突变具有外显不全,新生突变特征；临床上应注意PKD与发作性持续运动诱发性运动障碍及先天性肌强直的鉴别诊断。第二部分发作性运动诱发性运动障碍基因型一表型关系目的：探讨PKD基因型。表型关系及PRRT2突变与药物反应关系。方法：分2阶段收集81例PKD病例(家族性44例,散发性37例),Sanger法测PRRT2基因序列,采集临床资料,患者口服卡马西平。比较PRRT2基因突变携带者及非携带者的临床表现差异及对卡马西平的反应用t检验或卡方检验。结果：44例家族性患者及4例散发性患者发现4种PRRT2基因突变,包括c.514_517de1TCTG,c.649dupC,c.649delC,c.972delA。基因突变携带者临床表现为舞蹈手足徐动症(48例),而非携带者表现为舞蹈手足徐动症(7例)或肌张力障碍(26例)(P=3.8×10-15)；与不携带基因突变的患者相比,携带基因突变的患者起病年龄更早(分别为7.63+3.72岁,13.52±.69岁)(P=2.2×10-11),每次PKD发作持续时间更长(P=2.2×104)；所有的突变携带者对小剂量卡马西平(50mg/d)完全反应,而94%非基因突变携带者对相同剂量卡马西平反应不完全(P1.1×10-20)。我们另外发现一例携带PRRT2基因c.649dupC突变的PKD患者同时携带CLCN1基因C.1723CT及c.2492AG错义突变,提示其合并先天性肌强直。结论：PKD患者中PRRT2基因突变携带者较非携带者起病年龄更早,临床表现更重,但对小剂量卡马西平完全反应。当携带PRRT2突变的PKD患者对卡马西平反应不完全时应筛查其他基因。第三部分利用fMRI探讨发作性运动诱发性运动障碍发病相关脑区目的：利用fMRI探讨发作性运动诱发性运动障碍发病相关脑区方法：收集15例携带PRRT2突变的PKD患者(PKDm),15例不携带PRRT2突变的PKD患者(PKDnm),14例正常对照,Sanger法筛查PRRT2基因序列,西门子3.0 T核磁共振进行脑部扫描。结果：与正常对照相比,PKD患者的功能网络连接增加,而结构网络连接减少。功能网络分析提示PKDm组患者左侧顶叶上回,颞下回,双侧中央后回由非种子区变为种子区,而大脑的辅助运动区和背侧扣带回则由种子区变为非种子区；PKDnm组患者中,双侧楔前叶和顶下叶变为非种子区,而额上回变为种子区。结构网络分析提示PKD患者腹侧扣带回由种子区变为非种子区,而矩状裂由非种子区变为种子区。同时,额上回在PKDm组变为种子区,右侧尾状核和左侧岛叶在PKDnm组变为非种子区。结论：PKD患者的功能网络连接增加而结构网络连接减少。躯体感觉运动整合功能的异常可能是PKD的发病机制之一。第四部分发作性运动诱发性运动障碍发病机制初步探讨目的：初步探讨发作性运动诱发性运动障碍的发病机制方法：构建野生型(WT)及各种突变型(c.514_517delTCTG, c.649dupC, C.796CT,c.913GA,c.972delA)PRRT2慢病毒质粒,转染SH-SY5Y细胞,提取RNA进行RT-PCR及Real Time PCR。各稳转细胞株用10 μmol/L胞乳素干预24 h后提取总蛋白,Western Blot检测PRRT2蛋白改变。培养PKD患者及正常对照的尿液上皮细胞,利用携带6因子(Oct4、Sox2、cMyc、Klf4、Nanog、Lin28)的腺病毒转染尿液上皮细胞重编程得到诱导性多能干细胞(iPS),用碱性磷酸酶活性检测,畸胎瘤形成实验等鉴定iPS。结果：我们成功构建野生型及突变型PRRT2慢病毒质粒并测序验证成功,RT-PCR及Real Time PCR结果提示各突变型PRRT2细胞系与WT-PRRT2细胞mRNA水平无显著性差异。胞乳素干预后野生型PRRT2蛋白变化不明显,而突变型PRRT2蛋白水平明显增加。转染尿液上皮细胞后30天,得到形态类似ES的iPS克隆,用碱性磷酸酶活性检测提示细胞未分化,畸胎瘤实验提示可形成三个胚层。结论：突变型PRRT2不影响mRNA的水平但会增加蛋白的降解。利用尿液上皮细胞构建iPS方法可行,且获得的iPS具有多项分化潜能。
【关键词】：发作性运动诱发性运动障碍 PRRT2 卡马西平 fMRI iPS
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-19
• 参考文献16-19
• 第一部分 发作性运动诱发性运动障碍散发病例PRRT2基因突变特征19-36
• 材料与方法19-28
• 结果28-34
• 讨论34-35
• 小结35-36
• 第二部分 发作性运动诱发性运动障碍基因型表型关系36-51
• 材料与方法36-40
• 结果40-48
• 讨论48-50
• 小结50-51
• 第三部分 利用fMRI探讨发作性运动诱发性运动障碍发病相关脑区51-63
• 材料与方法53-55
• 结果55-61
• 讨论61-62
• 小结62-63
• 第四部分 发作性运动诱发性运动障碍发病机制初步探讨63-86
• 材料与方法63-78
• 结果78-84
• 讨论84-85
• 小结85-86
• 参考文献86-91
• 全文总结91-92
• 综述92-105
• 参考文献98-105
• 附表105-110
• 博士期间发表论文110-111
• 致谢111-112

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本文编号：954060