家蚕表达的霍乱病毒B亚基融合蛋白防治1型糖尿病和阿尔茨海默症研究

发布时间：2017-10-02 08:13

  本文关键词：家蚕表达的霍乱病毒B亚基融合蛋白防治1型糖尿病和阿尔茨海默症研究

  更多相关文章： 1型糖尿病 霍乱毒素B亚基 胰岛素 谷氨酸脱羧酶65 口服耐受 阿尔茨海默症 β样淀粉蛋白 免疫疗法

【摘要】：1型糖尿病(Type 1 diabetes, T1D)和阿尔茨海默症(Alzheimer's disease, AD)是威胁人类健康的两大疾病,二者之间存在着密切的联系。免疫疗法已被证明是一条有潜在应用前景的防治T1D和AD有效方法。第一部分口服家蚕表达的胰岛素和谷氨酸脱羧酶65双抗原防治1型糖尿病研究1型糖尿病(Type 1 diabetes, T1D)是一种由T细胞介导胰岛p细胞损伤的自身免疫性疫病。通过口服自身抗原诱导粘膜免疫耐受是预防和治疗T1D的有效方法。然而诱导口服耐受需要大量抗原,而且功效很低,这就限制了口服耐受在临床上的应用。在本研究中,我们设计了包含胰岛素,三拷贝的谷氨酸脱羧酶65 p531-545多肽和霍乱病毒B亚基融合蛋白(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins),通过家蚕生物反应器高效表达了该融合蛋白,并评价该融合蛋白对T1D的保护作用。我们的研究结果表明口服CTB-Ins-GAD可以抑制78%T1D,比单独口服胰岛素或者GAD65更有效。口服CTB-Ins-GAD可以诱导胰岛素和GAD65特异性的Th2型的免疫反应,更有利于修复Thl/Th2免疫失衡,另外,CTB-Ins-GAD可以诱导更多的CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞来抑制胰岛素和GAD65反应性T细胞的增殖和迁移。我们的研究结果表明联合双抗原结合家蚕生物反应器能促进口服耐受的诱导,因此,为T1D的治疗提供了一条经济有效的免疫疗法。第二部分口服家蚕表达的霍乱毒素B亚基与双重Aβ42融合蛋白防治阿尔茨海默症研究阿尔茨海默症(Alzheimer's disease, AD)的主要病理学特征包括脑中神经细胞外β-淀粉样多肽沉积形成的老年斑,细胞内过度磷酸化Tau蛋白导致的神经纤维缠结。Aβ是老年斑的主要成分,脑内出现病理性的Ap沉积是患AD的标志。主动或者被动免疫清除Aβ是目前被广泛研究的有很大潜力的治疗AD的方法。然而,用Aβ主动或者被动免疫提高了患脑膜炎或者引起脑出血的风险。在本研究中,我们通过家蚕生物感应器高效表达了包含霍乱病毒B亚基和两个拷贝的Aβ42的融合蛋白(CTB-(Aβ42)2),并评价了该融合蛋白对AD的保护作用。我们的研究结果表明口服CTB-(Aβ42)2诱导非致炎的Aβ42特异性的Th2型免疫反应,显著地降低了Aβ水平,老年斑面积和Tau蛋白的磷酸化水平,改善AD小鼠的记忆和认知功能,但是没有引起IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10等细胞因子水平的变化。我们的研究认为CTB-(Aβ42)_2对AD有治疗作用,为AD的治疗提供了一条经济有效的免疫疗法。
【关键词】：1型糖尿病 霍乱毒素B亚基 胰岛素 谷氨酸脱羧酶65 口服耐受 阿尔茨海默症 β样淀粉蛋白 免疫疗法
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1;R749.16
【目录】：

• 致谢6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 缩写表11-17
• 第一部分 口服家蚕表达的胰岛素和谷氨酸脱羧酶65双抗原防治1型糖尿病研究17-67
• 1 引言17-21
• 1.1 1型糖尿病17-18
• 1.2 口服耐受18-19
• 1.3 联合免疫疗法19
• 1.4 本研究的目的与意义19-21
• 2 实验材料与方法21-40
• 2.1 实验材料21-25
• 2.1.1 实验动物21
• 2.1.2 细胞系21
• 2.1.3 质粒和细菌21
• 2.1.4 抗体21
• 2.1.5 实验耗材与设备21-22
• 2.1.6 实验试剂22
• 2.1.7 相关试剂配置22-25
• 2.2 CTB-Ins-GAD和CTB-GAD-Ins杆状病毒的构建实验方法25-33
• 2.2.1 CTB-Ins-GAD和CTB-GAD-Ins融合基因的构建25-28
• 2.2.2 PCR产物凝胶回收28
• 2.2.3 PCR产物连接PMD19-T载体28
• 2.2.4 E.coli TG1感受态细胞的制备28-29
• 2.2.5 连接产物转化大肠杆菌(TG1或DH10)29
• 2.2.6 阳性克隆的扩大培养及质粒抽提29
• 2.2.7 阳性质粒的酶切鉴定29-30
• 2.2.8 重组杆状病毒质粒(Bacmid)构建30-31
• 2.2.9 杆状病毒的获得与鉴定31-33
• 2.2.9.1 家蚕卵巢细胞培养31-32
• 2.2.9.2 杆状病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)的获得32
• 2.2.9.3 杆状病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)的扩大培养32-33
• 2.2.9.4 杆状病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)感染能力测定33
• 2.2.9.5 杆状病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)基因组提取33
• 2.2.9.6 杆状病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)PCR鉴定33
• 2.3 融合蛋白的表达实验方法33-36
• 2.3.1 融合蛋白在家蚕卵巢细胞中的表达33-34
• 2.3.2 融合蛋白在蚕蛹中的表达34
• 2.3.3 Western blot实验方法34-35
• 2.3.4 ELlSA法测定表达量35-36
• 2.3.5 GM1-ELISA测定融合蛋白的GM1结合力36
• 2.4 口服融合蛋白防治T1D实验方法36-40
• 2.4.1 抗体及抗体亚型滴度检测36-37
• 2.4.2 胰腺组织切片37
• 2.4.3 口服CTB-Ins-GAD和CTB-GAD-Ins防治T1D效果检测37
• 2.4.4 Th1/Th2细胞ELISPOT分析37-38
• 2.4.5 IL-4/IFN-γ细胞因子浓度检测38
• 2.4.6 CD4+CD25+Foxp3+T细胞分析38
• 2.4.7 脾脏淋巴细胞体外增值能力分析38-39
• 2.4.8 脾脏淋巴细胞体外迁移能力分析39
• 2.4.9 过继转移实验方法39-40
• 3 实验结果与分析40-64
• 3.1 获得CTB-GAD、CTB-Ins、GAD、Ins片段40
• 3.2 构建CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD融合基因40-41
• 3.3 构建Bacmid(CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD)载体41-45
• 3.3.1 pBac(CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD)载体构建和鉴定41-42
• 3.3.2 重组Bacmid质粒的构建与鉴定42-43
• 3.3.3 重组杆状病毒的获得及鉴定43-44
• 3.3.4 BmV-CTB-GAD-Ins和BmV-CTB-Ins-GAD病毒滴度检测44-45
• 3.4 融合蛋白的表达及鉴定45-48
• 3.4.1 融合蛋白在家蚕细胞和蚕蛹高效表达45-46
• 3.4.2 Western Blot分析融合蛋白表达46-47
• 3.4.3 GM1结合ELISA检测蛋白活性47-48
• 3.5 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD减轻胰岛炎48-50
• 3.6 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD降低糖尿病发病率50-51
• 3.7 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD诱导胰岛素和GAD特异性的Th2型免疫反应51-53
• 3.8 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD诱导Th1向Th2型转化53-56
• 3.9 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD增加调节性T细胞分化56-58
• 3.10 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD抑制脾脏T细胞增殖58-60
• 3.11 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD抑制脾脏T细胞迁移60-62
• 3.12 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD诱导NOD小鼠产生调节性T细胞62-64
• 4 讨论64-67
• 第二部分 口服家蚕表达的霍乱病毒B亚基与双拷贝Aβ42融合蛋白防治阿尔茨海默症研究67-99
• 1 引言67-71
• 1.1 阿尔茨海默症67
• 1.2 阿尔茨海默症的治疗67-69
• 1.2.1 传统疗法67-68
• 1.2.2 免疫疗法68-69
• 1.3 本研究的目的意义69-71
• 2 实验材料与方法71-76
• 2.1 实验材料71-72
• 2.1.1 实验动物71
• 2.1.2 细胞系71
• 2.1.3 质粒和细菌71
• 2.1.4 抗体71
• 2.1.5 实验耗材与设备71
• 2.1.6 实验试剂71-72
• 2.1.7 相关试剂配置72
• 2.2 重组病毒的构建和鉴定实验方法72
• 2.2.1 融合基因的构建72
• 2.3 融合蛋白的表达与鉴定72
• 2.4 血清特异性抗体及抗体亚型的滴度检测72
• 2.5 AD小鼠行为学检测实验方法72-74
• 2.5.1 水迷宫检测72-73
• 2.5.2 旷场实验73
• 2.5.3 Y-迷宫实验73-74
• 2.6 小鼠脑中Aβ含量的检测74
• 2.7 小鼠大脑老年斑块的形态学检测74-75
• 2.8 小鼠脑中细胞因子浓度的检测75-76
• 3 实验结果与分析76-97
• 3.1 构建CTB-(Aβ42)_2融合基因76
• 3.2 构建包含CTB-(Aβ42)_2融合基因的Bacmid载体76-79
• 3.2.1 pFastBacl载体构建与鉴定76-77
• 3.2.2 重组Bacmid质粒的构建与鉴定77
• 3.2.3 重组杆状病毒的获得及鉴定77-79
• 3.2.4 BmNPV-CTB-(Aβ42)_2病毒滴度检测79
• 3.3 重组融合蛋白的表达及鉴定79-82
• 3.3.1 重组融合蛋白在家蚕细胞和蚕蛹高效表达79-80
• 3.3.2 Western Blot分析融合蛋白表达80-81
• 3.3.3 GM1结合ELISA检测蛋白活性81-82
• 3.4 AD小鼠血清抗体滴度检测82-83
• 3.5 AD小鼠行为学检测83-90
• 3.5.1 Morris水迷宫实验83-87
• 3.5.2 旷场实验87-88
• 3.5.3 Y-迷宫实验88-90
• 3.6 口服CTB-(Aβ42)_2减少小鼠血清和脑组织Aβ水平检测90-91
• 3.7 口服CTB-(Aβ42)_2减少AD小鼠大脑皮层和海马区老年斑面积91-92
• 3.8 小鼠脑组织细胞因子检测92-93
• 3.9 口服CTB-(Aβ42)_2改善AD小鼠PI3K/AKT信号通路93-94
• 3.10 口服CTB-(Aβ42)_2降低小鼠Tau蛋白磷酸化水平94-97
• 4 讨论97-99
• 结论与展望99-100
• 参考文献100-112
• 作者简历112

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