组蛋白去乙酰化酶-2（HDAC2）在慢性应激所致认知损伤中的作用机制探讨
发布时间：2017-10-04 21:13
本文关键词：组蛋白去乙酰化酶-2（HDAC2）在慢性应激所致认知损伤中的作用机制探讨
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【摘要】：背景生物有机体长期暴露于内源性或外源性的损伤因素刺激下,可通过糖皮质激素相关信号通路的活化,引起认知功损伤,甚至可以加重阿尔茨海默症(Alzheimer's Disease, AD)等疾病的认知障碍。表观遗传学调节尤其是组蛋白乙酰化／去乙酰化水平的调节,为其损伤机制的探讨提供了一个新的方向。慢性应激可以显著下调组蛋白乙酰化水平,抑制功能蛋白的表达,但机制并不清楚。组蛋白去乙酰化酶家族(Histone Deacetylases, HDACs)是催化组蛋白去乙酰化的关键酶,某些特定的HDAC成员被研究和发现参与到学习、记忆等相关认知功能活动的调节中,如HDAC2。HDAC2属于HDAC I类家族成员,其异常上调具有促进认知损伤的作用,在以认知功能障碍为显著表现的疾病当中,HDAC2常有明显上调。动物实验中,HDAC2敲除或抑制都可以显著改善认知功能。慢性应激可以下调组蛋白乙酰化水平,但是否可以通过以及主要通过某种特定的HDAC家族成员发挥组蛋白去乙酰化作用,仍然需要进一步研究和探讨。糖皮质激素受体与HDAC2均可表达于与学习记忆密切相关的海马、皮层等脑区,提示两者之间可能存在功能联系。AD模型小鼠中,活化的糖皮质激素受体可以结合在HDAC2蛋白基因启动子区域从而使的HDAC2蛋白在海马区域含量增加,而应激后同样存在糖皮质激素受体相关通路的活化,提示HDAC2可能参与到应激引起的认知功能障碍等过程中。为了探讨HDAC2在慢性应激所致的认知功能损伤这一过程中的作用,我们将从体外及体内两个方面,应用野生(C57BL/6J)及AD模型(APP/PS1)两种小鼠进行相应的阐述,旨在探讨HDAC2在慢性应激下野生小鼠的认知损伤以及在AD的疾病进展中认知功能加重的作用机制。方法体外实验中,采用小鼠神经母细胞来源的N2a细胞作为实验材料,采用corticosteroid(皮质酮)作为干预药物,选择corticosteroid (2μM,48h)处理细胞模拟体外慢性应激损伤。观察药物干预后细胞形态学、Postsynaptic Density Protein(PSD95)等功能蛋白水平的改变,确定损伤成功。随后进行机制探讨,检测HDAC2蛋白水平、组蛋白乙酰化水平、PI3K/AKT信号通路磷酸化水平的改变。采用HDAC2-shRNA转染沉默进行反向验证,检测相关指标改善情况,评价HDAC2在corticosteroid损伤N2a细胞中的作用,为体内实验提供提示。体内实验中,选用野生C57BL/6J小鼠和APP/PS1双转AD模型小鼠作为实验材料,采用慢性束缚性应激方式造成慢性应激损伤模型。观察小鼠认知相关行为学指标改变,检测小鼠海马HDAC2蛋白水平的改变及相关分子指标的改变,如突触可塑性分子：PSD95、Glutamic Acid Receptor-1 (GluR-1)、Synaptophysin (Syn)、GABA Receptor-A Subtype (GABAAR);神经营养因子：Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF);立早基因：Arc、Egr; PI3K/AKT信号通路磷酸化水平的改变,探讨HDAC2与认知损伤的相关性和可能机制。随后进行野生C57BL/6J野生小鼠HDAC2-shRNA海马内注射,进行海马神经元细胞的HDAC2沉默,检测小鼠行为学及相应的分子生物学指标是否有改善,评价HDAC2在慢性束缚性应激所致的认知功能损伤中的作用。结果体外实验中,corticosteroid干预后可造成N2a细胞损伤：(1)生长受抑,细胞平均密度降低,神经突样结构长度显著缩短；(2)PSD95表达显著下降；(3)PI3K/AKT(ser473)磷酸化水平显著降低。与此同时,N2a细胞的HDAC2蛋白水平显著上调,并伴随组蛋白H3K9位点的乙酰化水平显著下调。HDAC2沉默后,可以部分改善上述的细胞损伤：(1)形态学的部分恢复；(2)PSD95的部分回升；(3)PI3K/AKT(ser473)磷酸化水平的改善。体内实验中,慢性束缚性应激可明显损伤两种小鼠的学习记忆能力,显著升高海马区HDAC2的蛋白水平。野生C57BL/6J小鼠应激后,认知相关分子指标显著下降,如PSD95、GIuR-1、BDNF、Egr、AKT (ser473)磷酸化水平等；海马HDAC2沉默后,可显著改善其学习记忆能力,在一定程度上抵御了慢性应激下的认知损伤。结论本实验研究发现：HDAC2在慢性应激所致的认知功能损伤中上调,并起到损伤作用。结果提示：(1)HDAC2在慢性应激所致的认知功能损伤中上调,并起到损伤作用；(2)HDAC2沉默具有神经保护作用,可以在一定程度上抵抗慢性应激所致的认知功能损伤；(3)不同的年龄阶段对于应激损伤的抵抗能力不同,年老阶段对于应激损伤的抵抗能力显著下降,即更容易受到慢性应激的损伤,HDAC2可能是一个增加应激损伤敏感性的协同因素；(4)在某些以认知功能损伤为主要表现的疾病,如AD中,HDAC2的蛋白水平显著升高,但其上调的原因并不清楚,本实验结果提示慢性应激可能是相关疾病中HDAC2上调的原因之一,进一步探讨其中的调控机制,有助于疾病发病机制的深入和新的HDAC2抑制靶点发现。
【关键词】：慢性应激 组蛋白去乙酰化酶-2(HDAC2) 认知功能 阿尔茨海默症(Alzheimer's disease AD) 表观遗传学
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.1
【目录】：
- 摘要6-8
- Abstract8-10
- 前言10-14
- 第一部分 组蛋白去乙酰化酶-2 (HDAC2)在慢性应激所致的C57BL/6J小鼠认知损伤中的作用机制探讨14-94
- (一) HDAC2介导应激素Corticosteroid诱发的Neuro-2a细胞的功能损伤15-46
- 材料和方法15-29
- 一、材料15-22
- 1. 实验细胞15
- 2. 主要试剂及耗材15-17
- 3. 主要抗体来源及浓度17-18
- 4. 主要试剂配制方法18-21
- 5. 主要仪器设备21-22
- 二、方法22-28
- 1. 细胞培养22
- 2.药物配制22-23
- 3. MTT方法选取最佳药物干预浓度23
- 4. N2a 细胞 HDAC2-shRNA 沉默23-25
- 5. N2a细胞药物干预25
- 6. N2a细胞总蛋白提取25-26
- 7. BCA~（Tm） Protein Assay Kit 测总蛋白浓度26
- 8. SDS-PAGE 凝胶电泳及 Western Blot26-28
- 9. 细胞免疫荧光28
- 三、统计学方法28-29
- 结果29-43
- 1. Corticosteroid 损伤 N2a 细胞活性29-30
- 2. Corticosteroid损伤N2a细胞的形态30-31
- 3. Corticosteroid损伤N2a细施的功能31-32
- 4. Corticosteroid干预后上调了 HDAC2蛋白水平，同时下调了组蛋白H3K9的乙酰化水平32-35
- 5. LV-shRJVA-mHdac2 有效性检测35-38
- 6. HDAC2沉默改善N2a细胞病理学损伤38-39
- 7. HDAC2沉默改善了 N2a细胞功能的机制探讨39-43
- 讨论43-45
- 小结45-46
- (二) 组蛋白去乙酰化酶-2（HDAC2）参与到慢性束缚性应激所致的老年C57BL/6J小鼠的认知损伤中46-79
- 材料和方法46-61
- 一、材料46-53
- 1.实验动物46
- 2.主要试剂及耗材46-48
- 3.主要抗体来源及浓度48-49
- 4.主要设计配制方法49-52
- 5. 主要仪器设备52-53
- 二、方法53-60
- 1. 实验动物53
- 2. 慢性束缚性应激53-54
- 3. 行为学实验54-57
- 4.化组织蛋白提取57
- 5. BCA~(TM) Pro化in Assay Kit测总蛋芭浓度57-58
- 6. SDS-PAGE 凝胶电泳及 Western Blot58-59
- 7.血清 corticosteroid 水平检测59-60
- 8.免疫荧光染色60
- 三、统计学方法60-61
- 结果61-76
- 一. 慢性束缚性应激对小鼠行为学的影响61-67
- 二. 慢性束缚性应激后小鼠的形态学改变67-68
- 三、慢性束缚性应激后小鼠的血皮质酮升高68-69
- 四、慢性应激上调海马HDAC2蛋白水平69-72
- 五、慢性应激下调海马组蛋白乙酰化水平72
- 六、慢性应激下海马区影响突触可塑性的相关分子蛋自表达改变72-74
- 七、慢性应激下海马区立早基因水平的改变74
- 八、下调的神经营养因子BDNF74-76
- 讨论76-78
- 小结78-79
- (三) C57BL/6J小鼠海马区HDAC2沉默后认知功能的改变79-94
- 材料和方法79-83
- 一、材料79-80
- 1.实验动物79
- 2.主要试剂及耗材79
- 3.主要抗体来源及浓度79-80
- 4.主要试剂及配置方法见（二）部分80
- 5.主要仪器设备80
- 二、方法80-81
- 1. 实验动物80
- 2. 海马区shRNA注射80-81
- 3. 慢性束缚性应激81
- 4. 行为学实验81
- 5. 脑组织蛋白提取，，详见（二）部分81
- 6. BCA~（TM） Protein Assay Kit测总蛋白浓度，详见（二）部分81
- 7. SDS-PAGE凝胶电泳及Western Blot,详见（二）部分81
- 8.免疫荧光染色详见（二）部分81
- 三、统计学方法81-83
- 结果83-91
- —、海马HDAC2-shRNA干预后可显著降低海马HDAC2的蛋白水平83-84
- 二、HDAC2-shRNA干预后可部分改善小鼠的行为表现84-87
- 三. 相关分子改变机制87-89
- 四、HDAC2-shRNA海马区注射并未显著改善应激后小鼠的认知功能89-91
- 讨论91-93
- 小结93-94
- 第二部分 HDAC2加速慢性应激下APP/PS1双转AD模型小鼠的认知功能损伤94-105
- 材料和方法95-99
- 结果99-103
- 一. APP/PS1的鉴定99
- 二、免疫组化染色显示APP/PSl小鼠脑郁老年斑形成99-100
- 三、Morris水谜[形Ц谋
本文编号：972852
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