MicroRNA靶向Id1对BMSCs成骨分化的影响

  本文关键词：MicroRNA靶向Id1对BMSCs成骨分化的影响，由笔耕文化传播整理发布。

《山东大学》 2015年

MicroRNA靶向Id1对BMSCs成骨分化的影响

聂晓萌  

【摘要】：[研究背景]骨形成蛋白2 (Bone morphogenetic protein, BMP2)基因可促进骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)的成骨分化,但在成骨分化的终末期该基因可引起BMSCs成骨指标不佳。Idl因子在BMSCs成骨分化过程中的表达变化,是BMSCs成骨分化的关键。BMP2上调工d1因子的表达,提示Idl因子可能是BMP2高表达环境中BMSCs成骨分化的关键因子。通过miRNA芯片筛选发现某些miRNA表达水平在BMP2刺激和未刺激的BMSCs中存在显著差异,并且这些miRNA与通过生物信息学预测的可能调控Idl因子表达的miRNA相符合。[目的]阐述体外高表达BMP2及Idl因子的变化对大鼠BMSCs成骨分化的影响,验证Idl因子在BMP2修饰的BMSCs成骨分化中的重要作用,证明Id表达上调是BMP2抑制BMSCs成骨分化的原因并探寻BMP2对Idl的调控机制；拟筛选鉴定出靶向作用于Idl因子的miRNA分子,证明某些特定的miRNA表达变化可能是BMP2上调Idl表达的新分子机制,为颌面部骨缺损修复提供新的研究策略。[方法]1、分离及纯化培养Wistar大鼠的BMSCs,分别于不同时间点,显微镜下观察BMSCs的形态；取第3-5代BMSCs,进行成骨诱导,培养7-14天,进行茜素红染色,光学显微镜下观察矿化情况,进行成骨鉴定；取第3-5代BMSCs,进行成脂诱导,培养7-14天,进行油红0染色,光学显微镜观察着色脂滴,进行成脂鉴定。2、根据Genbank中Idl的mRNA序列设计合成引物,PCR扩增基因片段并鉴定PCR产物；对已构建的pDC316-BMP2-GFP重组腺病毒,进行滴度测定；腺病毒Ad-BMP2、Ad-GFP转染第2-3代BMSCs,病毒转染后绘制细胞生长曲线,检测病毒对细胞生长增殖的影响；取MOI值为40时,腺病毒Ad-BMP2、Ad-GFP转染第2-3代BMSCs,分别于不同时间点收集细胞(Ad-BMP2-BMSCs组、Ad-GFP-BMSCs组、BMSCs组),实时定量PCR检测细胞中目的基因Idl的表达。3、筛选靶向Idl基因的miRNA,应用miRNA在线数据库,针对Idl因子预测可能调控其表达的miRNA分子,根据评分结果加以选择,通过miRNA表达谱芯片及相关技术筛选,将芯片筛选和预测的结果进行分析,提取细胞的RNA,应用Real-time PCR方法检测验证miRNA的变化与芯片检测结果的一致性,筛选从而明确研究的miRNA。[结果]1、成骨诱导的BMSCs生长相对缓慢,细胞形态不规则,呈现多角形成骨细胞形态；诱导7天后,茜素红染色可观察到少量点状红色矿化结节的形成,诱导14天可观察到明显的矿化结节。2、脂肪诱导液诱导BMSCs,诱导后的细胞增殖稍缓慢,细胞形态相对展平；诱导14天后油红O染色可观察到脂滴形成。3、Ad-BMP2转染BMSCs48h后,荧光显微镜现观察细胞绿色荧光蛋白表达的情况,细胞表达绿色荧光比例随MOI值的增加而增高,当MOI值为40时,在荧光显微镜下观察有95%以上的细胞出现了绿色荧光。4、腺病毒转染后没有影响细胞的增殖,各组增殖数目间无显著差异(P0.05)。5、通过miRNA表达谱芯片及相关技术筛选其差异情况发现有123个miRNA下调,114个miRNA上调；将芯片筛选和预测的结果进行分析,发现一共有3个miRNA发生变化,miRNA-338、miRNA-195及miRNA-98;其中1个上调,2个下调。[结论]1、密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞,此方法可得到纯度较好的BMSCs,BMSCs具有成骨分化能力和成脂肪分化能力。2、Ad-BMP2重组腺病毒表达载体,滴度高转染效率好,为稳定且有效的基因表达载体,病毒转染后可使BMSCs过表达BMP2,最佳MOI值为40。3、在靶向Idl的miRNA分子中,生物预测结果与芯片检测结果一致的是：miRNA-338上调、miRNA-195及miRNA-98下调。

【关键词】：
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R78
【目录】：

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