静压力作用下经典Wnt信号通路调控牙周膜干细胞骨向分化的机制研究

发布时间：2016-11-14 19:57

  本文关键词：静压力作用下经典Wnt信号通路调控牙周膜干细胞骨向分化的机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

《第四军医大学》 2015年

静压力作用下经典Wnt信号通路调控牙周膜干细胞骨向分化的机制研究

马小杰  

【摘要】：正畸牙移动(orthodontic tooth movement,OTM)涉及了复杂的生物学行为,主要包括两个层面的内容:生物力学和生物学,前者是指机械刺激作用于牙齿,产生张应力和压应力,而后者是指牙齿感受应力,并将其传递至牙周组织,从而引发了一系列复杂的细胞生物学反应,二者相互关联,协同作用。有研究证实,在OTM过程中,张力侧成骨活跃,主要表现为以骨沉积为主的骨塑建;而压力侧成骨/破骨动态平衡,以骨吸收为主。了解更多更新的OTM发生发展的生物学基础,将有助于我们更加安全有效的开展临床工作。众所周知,在OTM过程中,牙周组织感受机械应力,并产生生物学效应,是保证牙齿移动的关键因素。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)存在于牙周组织,可自我更新,并分化为成骨细胞等成熟细胞。有文献报道称,PDLSCs参与维持牙周膜内环境的稳态,在牙槽骨改建中发挥了一定的作用,推测其在OTM过程中扮演了重要的角色。随后,有学者利用大鼠OTM模型证实,随着加力时间的延长,不仅张力侧牙周膜内PDLSCs的数目逐渐增多,而且压力侧PDLSCs亦呈上升趋势,提示其参与了OTM。而体外细胞力学加载实验虽已发现,在牵张力等机械刺激的作用下,PDLSCs的增殖和分化等生物学特性会发生明显改变,但关于压应力对其生物学行为影响的研究很少且机制不清。但目前已有研究证实,Wnt信号通路广泛存在于生物体内,参与调节骨源性细胞对机械刺激的适应性反应,在骨的形成和改建中发挥了重要的作用。因此本课题首先建立大鼠OTM模型,通过检测PDLSCs在大鼠牙周膜内的表达,为其参与OTM提供了新的证词;随后使用可控液压加载装置,模拟体内PDLSCs的受压环境,通过检测体外培养的PDLSCs受压后成骨分化相关指标的表达变化,探讨OTM过程中压力对PDLSCs骨向分化能力的影响;最后,本实验还通过检测压力作用下经典Wnt信号通路对PDLSCs骨向分化能力的调控,为OTM过程中细胞生物学反应及其发生机制提供了理论和实验基础。第一部分大鼠OTM模型的研究研究目的构建大鼠OTM模型,检测PDLSCs在大鼠牙周膜内的表达,证实PDLSCs参与了OTM。研究方法按随机原则,将大鼠分为4组,包括对照组和实验1、3、7d组,每组6只,其中空白对照组不施加任何压力装置,而正畸加力组则以上颌切牙为支抗,用螺旋镍钛拉簧拉大鼠右上颌第一磨牙近移。加力完成后取材,HE染色观察牙周组织形态学变化。TRAP染色检测压力侧牙周膜内破骨细胞的数目变化。免疫组化染色观察干细胞标记nestin和PDGFRα的表达。研究结果(1)HE染色结果显示,牙周组织形态学变化具有时间依赖性,表现为与对照组相比,随着加力时间的增长,压力侧牙周膜间隙逐渐缩小,牙槽骨吸收越来越严重。(2)TRAP染色结果显示,大鼠压力侧牙周膜内靠近牙槽骨吸收凹陷处可见破骨细胞。(3)免疫组化染色结果显示,与对照组相比,随着加力时间的延长,大鼠压力侧牙周膜内nestin与PDGFRα的表达呈上升趋势。结论PDLSCs在大鼠牙周膜内的数目增多及分布更广,表明其参与了OTM。第二部分压力对h PDLSCs成骨分化能力的影响研究目的使用可控液压加载装置,模拟体内h PDLSCs的受压环境,检测受压后h PDLSCs的成骨相关指标的表达变化,探讨压力对h PDLSCs骨向分化能力的影响。研究方法(1)体外分离培养h PDLSCs,对其干性和分化能力进行鉴定(2)使用压应力加载装置,对体外培养的h PDLSCs施加100KPa的静压力,分别于加压处理1h和12h后,收集样品,检测h PDLSCs成骨分化能力的改变。研究结果(1)使用有限稀释法分离培养的h PDLSCs,克隆形成率为28%。干性鉴定结果显示,干细胞标记物CD105、CD29、CD44和stro-1表达呈阳性,而CD34和CD45的表达呈阴性。ALP染色、茜素红染色、Western blot和RT-PCR结果显示,诱导后其成骨分化能力增强;油红染色、Western blot和RT-PCR结果显示,诱导后其成脂分化能力增强。(2)当100KPa的静压力作用1h时,ALP染色及其活性检测结果显示,h PDLSCs成骨分化能力增强;Western blot和RT-PCR结果显示,h PDLSCs表达ALP和RUNX2明显升高。而当压力持续至12h时,ALP染色及其活性检测结果显示,h PDLSCs成骨分化能力降低;Western blot和RT-PCR结果显示,ALP和RUNX2表达量下调。结论(1)通过有限稀释法分离培养的h PDLSCs具有干细胞特性。(2)适宜的静压力在短时间内上调了h PDLSCs的成骨能力,而长时间内则对其起抑制作用。第三部分经典Wnt信号通路对PDLSCs成骨分化能力的影响研究目的通过检测压力作用下经典Wnt信号通路相关指标的表达变化以及调节通路后h PDLSCs成骨分化能力的改变,明确经典Wnt信号通路对h PDLSCs成骨分化能力的影响。研究方法(1)组织切片免疫组化染色,观察大鼠压力侧牙周膜内经典Wnt信号通路效应分子active-β-catenin的表达变化。(2)Western blot和RT-PCR检测100KPa/1h和100KPa/12h的静压力作用下经典Wnt信号通路相关指标的表达变化。(3)在100KPa/1h和100KPa/12h的压力条件下,分别使用wnt3a和DKK1调节经典Wnt信号通路后,ALP染色及其活性检测观察h PDLSCs成骨分化能力的改变,Western blot和RT-PCR检测h PDLSCs表达ALP和RUNX2的变化。研究结果(1)免疫组化结果显示,随着加力时间的延长,大鼠压力侧牙周膜中active-β-catenin的表达呈上升趋势。(2)Western blot结果显示,当100KPa的静压力作用1h后,h PDLSCs表达P-GSK-3β、active-β-catenin和β-catenin下降,而GSK-3β的表达量上升;当压力持续到12h时,检测结果与上述相反。RT-PCR结果无统计学意义。(3)静压力作用下,上调经典Wnt信号通路后,ALP染色及其活性检测结果显示,h PDLSCs的成骨能力被抑制;Western blot和RT-PCR结果显示,ALP和RUNX2的表达下降。而抑制经典Wnt信号通路后,结果与上述相反。结论(1)经典Wnt信号通路参与了OTM。(2)静压力在短时间内抑制了经典Wnt信号通路,而长时间则对其起促进作用。(3)静压力作用下,经典Wnt信号通路对h PDLSCs的成骨分化起负调控作用。

【关键词】：
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R783.5
【目录】：

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