磷酸三钙修复大鼠颅骨临界缺损的实验研究

发布时间：2017-01-15 10:59

  本文关键词：膜型基质金属蛋白酶1在预血管化膜片构建中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

《兰州大学》 2015年

预血管化的组织工程骨膜复合β-磷酸三钙修复大鼠颅骨临界缺损的实验研究

高鹏  

【摘要】：目的：探索以大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSC)为基础,利用细胞膜片技术在体外构建具有成骨和成血管特性的仿生无支架组织工程骨膜；并进一步将仿生骨膜与β-TCP复合,修复大鼠颅骨临界缺损(critical-sized calvarial defects,CSD)。方法：(1)预血管化仿生骨膜的体外构建：全骨髓贴壁法分离培养rBMSC,MTT法观察细胞生长增殖周期；rBMSC在条件诱导液中(10μg/l血管内皮细胞生长因子,VEGF;2μg/1碱性成纤维细胞生长因子,BFGF)向血管内皮样细胞(endothelial-like cells,ECs)诱导分化,于诱导后14天,镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪检测ECs表面标志物CD31；将rBMSC在干细胞培养介质中连续培养14天形成未分化膜片,并将诱导获得的ECs播种于未分化rBMSC膜片上,体外构建预血管化的细胞膜片,CD31免疫组化染色观察膜片上血管网络的形成；将rBMSC在成骨诱导介质中连续培养14天形成膜片,14天后行碱性磷酸酶(ALP)染色,诱导21天后行茜素红染色检测细胞膜片成骨分化能力；将成骨膜片包裹β-TCP后,再与预血管化膜片复合形成仿生骨膜β-TCP复合物。体外复合培养3天,扫描电镜(SEM)下观察细胞与材料复合情况；(2)仿生骨膜／β-TCP复合体修复大鼠颅骨临界缺损：将复合物植入大鼠颅骨8mm临界缺损区,以自体骨膜β-TCP,β-TCP,空白组作为对照组；于植入后2,4,8周处死动物,观察缺损区修复情况。2周标本行HE染色,CD31免疫组化染色,并计数血管密度；4,8周标本行X线检测；8周标本HE染色,Van Gieson染色,使用ImageJ软件,计算各组标本新骨形成量。结果：(1)贴壁的原代rBMSC呈三角形,短梭形,克隆样生长；传代后细胞增殖快,呈典型的长梭形,MTT检测生长曲线呈“S”型。加入内皮细胞诱导液的rBMSC,14天时细胞变短,呈圆形,椭圆形,呈典型的铺路石样；流式细胞仪检测ECs转化率为35.1%；高密度体外培养的rBMSC 14天时,皿底可见细胞呈片状,遮光性强,边缘卷曲,镊子可提起；ECs接种到单纯rBMSC膜片后7天,镜下可见细胞重新排列；CD31免疫组化染色后镜下可见ECs迁移,聚集,形成空泡样结构,管腔形成；成骨诱导形成的rBMSC膜片14天时ALP,21天时茜素红染色呈阳性表达；仿生骨膜β-TCP支架材料体外复合培养3天扫描电镜下(SEM)可见细胞向支架材料内部生长迁移,铺开。(2)植入物2周时,CD31免疫组化染色统计各组新生血管数显示：仿生骨膜/β-TCP组血管化能力显著高于β-TCP支架组,空白组(P0.05),与自体骨膜/β-TCP组相当(P0.05)。植入物8周时大体观,仿生骨膜β-TCP组,自体骨膜β-TCP组材料部分吸收,β-TCP组未见明显吸收,空白组缺损区纤维组织覆盖；Van Gieson染色染色统计分析新生骨量,仿生骨膜/β-TCP组,自体骨膜β-TCP组新骨形成量无统计学差异(P0.05),两组均大于β-TCP支架组和空白组(P0.05)。结论：(1)全骨髓贴壁法取材简单易于掌握,细胞增殖力强；经诱导形成的ECs播种在rBMSC膜片上共培养可以形成微血管网络结构；rBMSC经成骨诱导后可构建成骨分化能力的细胞膜片。(2)仿生骨膜／β-TCP可以用于大鼠颅骨临界缺损的修复。

【关键词】：
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R78
【目录】：

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