过表达NICD慢病毒载体对人的牙髓干细胞增殖分化影响的实验研究

发布时间：2018-12-31 14:53

【摘要】：牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells DPSCs)这一概念最早是由Shi S和Gronthos S在2000年提出，其与成骨细胞类似为间充质细胞来源，被认为是成熟牙髓组织的前体，在生理或病理状态下能够分化为成牙本质细胞，进而形成修复性牙本质。同大多数干细胞一样，牙髓干细胞在体外培养的过程中也会发生自分化，逐渐失去自我更新的能力。因此作为牙组织工程中种子细胞的重要来源，使得其在体外培养的过程中保持干性避免自分化是亟待解决的问题。 Notch信号通路调控着细胞间的分化、增殖和凋亡。其最基本也是最重要的作用体现在其介导的侧抑制作用使细胞分化相关的特异性基因表达受阻，从而使得细胞处于较原始的未分化状态。因此有学者提出利用Notch通路的“分化抑制作用”使得干细胞在体外培养的过程中保持自我更新能力。利用这一理念，通过在造血干细胞中过表达Notch受体，使得造血干细胞在体外培养成功获得了“永生”。相邻细胞间位于胞膜上的Notch配体和受体结合，从而暴露出Notch1的胞内段NICD（Notch intracellular domain），活化的NICD转移至胞核内将激活Notch通路的靶基因，从而激活Notch信号。已有学者证实外源性NICD能够激活细胞内Notch通路下游的基因，其对靶基因的调控与Notch配体和受体结合后所诱导的Notch信号激活途径一致。因此在细胞内过表达NICD，来模拟Notch途径上调的过程被广泛应用于Notch通路的研究中。本实验旨在通过慢病毒载体介导的NICD转染人的DPSCs，上调DPSCs中NICD的表达，探究其对DPSCs增殖和分化的影响，并初步探讨Notch通路对DPSCs增殖和分化的作用机制。目的：构建稳定过表达NICD的牙髓干细胞；观察过表达NICD对牙髓干细胞增殖分化的影响；初步研究Notch通路对DPSCs增殖和分化的作用机制。方法： 1.稳定过表达NICD的牙髓干细胞的建立：复苏前期实验组的原代人牙髓干细胞，镜下观察细胞形态，确定细胞活性良好；转染外源性的过表达NICD的慢病毒载体，使用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞株，western blot技术和RT-PCR技术验证转染后NICD表达水平上升，细胞免疫荧光技术观察NICD表达量及其表达位置的改变。实验分为DPSCs/NICD组、DPSCs/vector组、DPSCs/wt组。 2.观察过表达NICD后对牙髓干细胞增殖、迁移和分化的影响：通过CCK-8法和流式细胞技术检测S期的改变，观察外源性NICD对牙髓干细胞增殖的影响；诱导细胞分化并通过western blot技术检测牙髓干细胞分化的特异性蛋白DSPP的表达；Transwell检测三组细胞迁移能力的强弱。实验分组同上。 3.过表达NICD对DPSCs增殖和分化的作用机制研究：western blot技术和qRT-PCR技术观察Hes1、Runx2的表达改变，实验分为DPSCs/NICD组、DPSCs/vector组。通过siRNA-Hes1，观察抑制Hes1表达后，Runx2和DSPP的表达变化，探讨Notch通路调节DPSCs增殖和分化的作用机制。实验分组：DPSCs/vector组、DPSCs/NICD组、DPSCs/vector/siRNA-Hes1和DPSCs/NICD/siRNA-Hes1。结果： 1.成功建立稳定过表达NICD的牙髓干细胞，NICD在DPSCs/NICD组的表达明显高于DPSCs/vector组和DPSCs/wt组，并且加速其核内表达，而后两者之间的表达没有显著差异。 2.相对于DPSCs/vector组和DPSCs/wt组，DPSCs/NICD组的增殖能力明显增强，S期比例上升，DSPP表达显著下调，细胞迁移能力明显增强，而前两组之间未见明显差异。 3.过表达NICD后，DPSCs/NICD组的Hes1表达明显上调，Runx2的表达明显下调，与DPSCs/vector组相比较均有显著性差异。siRNA-Hes1后，与对照组相比较，各组Hes1的mRNA和蛋白表达均有不同程度的下调，，其中，DPSCs/vector/siRNA-Hes1组表达下调最为显著，与DPSCs/NICD组相比有显著性差异；siRNA-Hes1后，Runx2和DSPP的mRNA和蛋白表达均称上升趋势，各组与对照组相比较均有显著性差异，其中，与DPSCs/vector组相比较，DPSCs/vector/siRNA-Hes1组的Runx2和DSPP表达上调最为明显。结果显示，Runx2与DSPP表达呈正相关。结论： 1.转染过表达NICD的慢病毒颗粒后，NICD可在体外培养的DPSCs中呈稳定性的高表达。 2.过表达的NICD促进牙髓干细胞的增殖和迁移，抑制了牙髓干细胞的成牙本质分化。 3.过表达NICD后，促进DPSCs中Notch通路靶基因Hes1的表达并抑制Runx2的活性，从而抑制DSPP的表达以及DPSCs的分化；抑制Hes1的活性上调Runx2和DSPP的表达，促进DPSCs向成牙本质细胞的分化。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R781.3

【参考文献】