慢性牙周炎患者唾液miRNA-146a的表达及其临床意义分析

发布时间：2017-03-21 23:07

  本文关键词：慢性牙周炎患者唾液miRNA-146a的表达及其临床意义分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：口腔组织健康被世界卫生组织列为人类健康的十项标准之一,其中牙周病是口腔的两大类主要疾病之一。慢性牙周炎(chronic periodontitis)是最为常见的一类牙周病,约占95%以上,临床上常表现为牙周袋形成、附着丧失和牙槽骨吸收、牙齿松动,最后可导致牙齿丧失,是我国成年人失牙的首要原因。慢性牙周炎是一种多因素作用的疾病,其病变过程涉及复杂的微生物和宿主因素的相互作用,宿主对细菌侵袭的应答反应是决定其发生与否,病情严重程度、范围大小、发展速度等的重要因素,目前其确切发病机制仍未完全明确。唾液中含有大量血液中存在的分子物质,如蛋白、RNA、DNA、病毒颗粒等。所以唾液被喻为“人体健康的一面镜子”,能提示人体的多种疾病状态,如感染性疾病、肿瘤和心脑血管疾病等。近年,有关唾液检测与疾病诊断的研究逐渐增加,而唾液miRNA作为一种新的检测标志物逐渐受到研究者的关注。有研究报道组织、血浆和唾液三者具有相似的miRNA表达谱,即若干个同种miRNA在患者的病变组织、血液和唾液中的表达同时发生了显著的变化。目前对于唾液中miRNA在慢性牙周炎中的表达国内外研究较少见。miRN A是一类内源性、序列高度保守、大小约22个核苷酸的单链非编码小IRNA。miRNA在转录后水平对基因的表达进行负调控,其原理是通过与基因mRNA3'非转录区(3'UTR)互补配对,导致mRNA的降解或翻译抑制。随着RNA组学以及生物信息学预测的不断发展,目前已在人体内发现530余种miRNA,其在人类疾病发生发展过程中具有重要作用。研究人员在口腔鳞癌患者唾液中检测出多种稳定存在的miRNA分子,采用荧光定量PCR检测结果发现miRNA-200a和miRNA-125a在口腔鳞癌患者唾液中表达显著降低。吴伟东等通过检测食道癌患者和健康对照者唾液中miRNA表达谱发现,食道癌患者唾液中miRNA-144存在高表达,可作为早期诊断食道癌的基因标志物。Xie等研究发现唾液中miRNA-3679-5p和miRNA-940可作为胰腺癌的潜在非侵入性诊断标志物。已明确miRNA在免疫系统中起着调节作用,其中miRNA-146a是第一个被发现的与免疫炎症密切相关的miRNA。它是一个典型的多功能基因,在固有免疫中作用重大,参与免疫、炎症、造血和肿瘤等多种生理病理过程的发生、发展。人类miRNA-146由22个核苷酸组成,包括I]iRNA-146a和miRNA-146b两种形式,miRNA-146a位于人体的第5号染色体的LOC285628基因上,成熟序列位于第二外显子上。其中miRNA-146a在单核细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞等多种免疫和炎症细胞中高度表达。近期,Xie等通过基因芯片分析技术检测发现,牙周炎患者牙龈组织中包含miRNA-146a在内的一些miRN A表达上调。此外,研究还发现miRNA-146a及其靶蛋白基因的多态性与慢性牙周炎易感性相关。根据以上内容,我们推测miRNA-146a可能参与了慢性牙周炎的发病过程,但其机制还尚不清楚。本研究拟通过茎环逆转录实时定量PCR检测慢性牙周炎患者及健康对照者唾液中miRNA-146a表达水平,分析其表达水平与牙周炎症程度的关系；通过对慢性牙周炎患者实施牙周基础治疗,对比治疗前后唾液中miRNA-146a的水平,并探讨其与牙周临床指标及炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10分泌的关系,为牙周病基础治疗效果评估和病情发展预测等方面奠定基础。本论文分为以下两个部分内容第一部分慢性牙周炎患者唾液中miRNA-146a及相关因子表达水平的检测1.目的本研究拟通过茎环逆转录实时定量PCR检测慢性牙周炎患者及健康对照者唾液中miRNA-146a表达水平的差异,分析其表达水平与牙周主要临床指标及炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10分泌的关系,为慢性牙周炎的临床诊断和治疗提供参考。2.方法(1)研究对象：根据1999年美国牙周病分类研讨会提出的慢性牙周炎的诊断标准,慢性牙周炎患者(牙周炎组)选取自2012年1月至2014年5月于西南医院口腔科就诊的64例病患,其中男性38例,女性26例,平均年龄44岁。同时健康对照组选择本院体检的30例健康志愿者,包括男性17例,女性13例,平均年龄42岁。(2)牙周检查及分组：详细记录所有研究对象牙周临床指标：菌斑指数(plaque index, PLI)、牙龈指数(gingival index, GI)、牙周探诊深度(p robing depth,PD)和附着丧失(attachment loss, AL)。根据探诊深度、牙龈指数、附着丧失、X线片显示牙槽骨吸收程度来衡量牙周炎的程度,分组如下：①健康对照组：牙龈指数=0,无附着丧失及牙槽骨的吸收,牙周探诊深度3mm,共30例。②轻度牙周炎组：牙龈指数1,附着丧失1～2 mm,牙槽骨吸收长度1/3根长,牙周探诊深度gmm,牙松动不明显,共18例。③中度牙周炎组：牙龈指数1,附着丧失3～4mm,牙槽骨吸收长度为1/3根长～1/2根长,牙周探诊深度6mm,多根牙有轻度根分叉病变,牙轻度松动,共24例。④重度牙周炎：牙龈指数1,附着丧失≥5mm,牙槽骨吸收长度1/2根长,牙周探诊深度6mmm,根分叉病变明显,牙多有松动,共22例。(3)唾液采集：清晨采用棉签法采集受试者的唾液标本,在唾液采集前2小时受试者需空腹,不能喝水、喝酒、喝饮料、进食、抽烟、剧烈运动及情绪剧烈波动等。采样时受试者坐位、头稍前倾体位,棉签蘸柠檬酸刺激口腔唾液分泌,1.5分钟后吐出唾液,用10ml无RNA酶离心管收集唾液标本,立即于4℃,3000rpm,15分钟离心取上层液体,将收集好的唾液上清冻存于_80-C备用。(4)唾液上清miRNA-146a表达检测：吸取lml唾液上清提取和纯化唾液上清中的总RNA,提取步骤参照mirVana PARIS Kit试剂盒说明书进行。以miRNA-16作为内参,采用茎环引物进行反转录。用TaKaRa公司PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒对提取的总RNA中的miRNA-146a反转录成cDNA。于-80-C冻存反转录产物待用。在ABI StepOne Plus实时定量PCR (Real-time PCR, RT-qPCR)仪上按照SYBR Premix Ex TaqTM PCR反应试剂盒进行RT-qPCR检测。反应总体积为20μl,每个标本做3个复孔。计算各标本平均循环阈值(cycle threshold, Ct),将miRNA-146a的Ct值减去miRNA-16 Ct值作为ACt值。采用相对定量法对RT-qPCR结果进行分析,计算标准化后的2-ACt值表示miRNA-146a的相对表达含量。(5)唾液上清中TNF-a, IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10水平的检测：采用酶联免疫吸附反应法(ELISA)检测唾液上清样本中的TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10水平,操作按说明书进行：将标准品稀释至ELISA反应板中,每块ELISA反应板设置8孔标准孔；吸取100μl待检样品加入ELISA反应板中,轻轻混匀,37℃孵育2小时；吸取100山第一抗体工作液加入ELISA反应孔中,混匀,37℃孵育1小时；洗板机洗板,洗5次,每次45秒；洗板结束后在ELISA反应孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的二抗,轻轻混匀,37℃温育1小时；洗板机洗板,洗5次,每次45秒；洗板结束后每孔加入底物A液和B液各50μl,轻轻混匀,37℃温育30分钟；加入50μl终止液,轻轻混匀；在450nm波长处测定各孔的OD值；以标准品浓度为横座标,相应的OD值为纵座标进行曲线拟合,作出标准曲线,根据拟合的标准曲线计算出各检测样本中细胞因子的含量。(6)统计学分析：实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料采用x±s表示,组间比较采用LSD-t检验,以P0.05为差异有统计学意义。miRNA-146a表达水平与PLI、GI、PD和AL临床指标及TNF-a, IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10水平的关系采用Pearson相关系数分析。3.结果(1)慢性牙周炎组唾液上清中miRNA-146a的表达(2.72±0.81)显著高于健康对照组(0.82±0.36),差异有统计学意义(P0.01)。(2)轻度慢性牙周炎组唾液上清中miRNA-146a表达水平为1.92±0.44,中度牙周炎组为2.71±0.58,重度牙周炎组为3.40±0.62, miRNA-146a在轻度牙周炎、中度牙周炎、重度牙周炎之间表达呈显著增高(P0.01)(3)慢性牙周炎组唾液上清中miRNA-146a的表达水平与菌斑指数、牙龈指数、牙周探诊深度和附着丧失呈显著正相关,相关系数分别为r=0.752,P0.001; r=0.657, P0.001; r=0.586, P0.001; r=0.647, P0.001。(4)慢性牙周炎患者唾液上清中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8的平均值分别为9.46±6.72 pg/ml,48.20±14.97 pg/ml、6.26±4.05 pg/ml、145.97±43.68pg/ml,均显著高于对照组,差异有统计学意义(P0.01)。而IL-10水平(平均值为6.74±4.31 pg/ml)则显著低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。(5)慢性牙周炎组唾液上清中miRNA-146a的表达水平与唾液中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8水平呈显著正相关,相关系数分别为r=0.516,P0.001；r=0.471, P0.001; r=0.442, P0.001; r=0.378, P0.01,与IL=10水平则呈负相关,相关系数为r=0.319,P0.01。4.结论(1)慢性牙周炎组及健康对照组的唾液上清中均可检测到miRNA-146a表达,前者表达水平显著高于后者。(2)慢性牙周炎组中,随着牙周破坏程度增加,患者唾液上清中miRNA-146a表达呈增高趋势。(3)慢性牙周炎患者唾液上清中miRNA-146a表达与PLI、GI、PD和AL呈正相关性,提示其与牙周炎破坏程度密切相关。(4)慢性牙周炎患者唾液上清中miRNA-146a表达与唾液中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8呈正相关性,与IL-10呈负相关性。第二部分牙周基础治疗对慢性牙周炎患者唾液中miRNA-146a及相关因子表达水平的影响1.目的采用茎环逆转录实时定量PCR检测慢性牙周炎患者在牙周基础治疗前后唾液上清中miRNA-146a表达情况,分析miRNA-146a表达在牙周基础治疗前后的变化趋势及其与牙周炎症程度之间的关系,探讨唾液上清中miRNA-146a是否可以为监测基础治疗疗效的客观指标。2.方法：以上述64例慢性牙周炎患者为研究对象进行牙周基础治疗,治疗前对纳入分析的慢性牙周炎患者进行口腔卫生宣教及口腔卫生指导,包括牙刷使用频率及方法、牙线使用等,然后行全口超声龈上洁治术、龈下刮治及根面平整术,治疗全过程在2周内完成。治疗后不给予抗生素辅助治疗。嘱患者治疗结束后第6周末进行牙周临床指标、唾液上清miRNA-146a及细胞因子TOF-a、IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10水平复查。采用SPSS 17.0统计学软件对实验结果数据进行统计分析。计量资料采用x±s表示,牙周基础治疗前后唾液中miRNA-146a的表达水平比较采用配对t检验,以P0.05为差异有统计学意义。基础治疗前后miRNA-146a变化值(AmiRNA-146a)与牙周主要临床指标变化值及细胞因子变化值的关系采用Pearson相关系数分析。3.结果(1)最终按要求完成牙周基础治疗后进行复诊的患者共48例。慢性牙周基础治疗后第6周观察牙的P LI、GI、PD和AL均较治疗前显著降低,差异有统计学意义(P0.01)。(2)48例治疗组患者基础治疗前(基线)唾液上清中miRNA-146a表达为2.85±0.92,治疗后第6周唾液上清中miRNA-146a表达为1.49±0.52,差异有统计学意义(P0.05)。(3)直线相关分析结果显示,基础治疗前后△miRNA-146a与治疗前后菌斑指数变化值(APLI)、牙龈指数变化值(AGI)、牙周探诊深度变化值(APD)和附着丧失变化值(△AL)呈显著正相关,相关系数分别为r=0.412,P0.01；r=0.506,P0.001；r=0.470,P0.001：r=0.584,P0.001。(4)慢性牙周基础治疗后第6周唾液中TNF-a, IL-1β、IL-6和IL-8表达水平显著降低,与治疗前(基线)相比,差异有统计学意义。(5)基础治疗前后AmiRNA-146a与治疗前后唾液中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8变化值(ATNF-a、AIL-1β、AIL-6、AIL-8)呈显著正相关,相关系数分别为r=0.547, P0.001; r=0.416, P0.001; r=0.352, P0.01; r=0.327, P0.01,与IL=10变化值(AIL-10)则呈负相关,相关系数为r=0.403,P0.01。4.结论(1)牙周基础治疗能显著降低慢性牙周炎患者PLI、GI、PD和AL临床指标,提示基础治疗可以有效改善牙周组织的炎症状况。(2)慢性牙周炎患者经基础治疗后唾液上清中miRNA-146a表达降低。(3)牙周基础治疗前后唾液上清miRNA-146a变化值与治疗前后PLI.GI、PD和AL的变化值呈正相关性。(4)牙周基础治疗前后唾液上清AmiRNA-146a与治疗前后唾液中ATNF-a, AIL-1β、AIL-6、AIL-8呈正相关性,与AIL-10呈负相关性。
【关键词】：慢性牙周炎 唾液 微小RNA miRNA-146a
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781.4
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-27
• 第一章 慢性牙周炎患者唾液中miRNA-146a及相关因子表达的检测27-45
• 1. 材料与方法27-35
• 2. 结果35-40
• 3. 讨论40-45
• 第二章 牙周基础治疗对慢性牙周炎患者唾液中miRNA-146a及相关因子表达的影响45-60
• 1. 材料与方法45-51
• 2. 结果51-55
• 3. 讨论55-60
• 全文总结60-61
• 参考文献61-69
• 英文缩略词69-70
• 成果70-71
• 致谢71-72

【参考文献】

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1 束蓉;;牙周病病因及治疗研究进展[J];上海交通大学学报(医学版);2007年06期

  本文关键词：慢性牙周炎患者唾液miRNA-146a的表达及其临床意义分析，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：260442