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趋化因子受体4基因沉默对人涎腺粘液表皮样癌Mc3细胞增殖和转移的抑制作用

发布时间:2020-11-14 02:40
   人涎腺粘液表皮样癌(Mucoepidermoid Caecinoma,MEC)是涎腺最常见的恶性肿瘤,约占涎腺恶性肿瘤的30%,尽管有时表现像良性病变,生长比较慢,但是该肿瘤有时是高度恶性而且预后很差。低分化的涎腺粘液表皮样癌侵袭和转移能力强,5年的存活率不超过43%。 趋化因子属于小分子趋化性细胞因子超家族成员,可通过与G蛋白耦联的受体相互作用,诱导细胞骨架重建、对内皮细胞的粘附和定向性迁移。趋化因子受体4(Chemokine receptor 4, CXCR4)是一种7次跨膜趋化因子受体,其重要配体是(基质细胞衍生因子-1, Stromal cell-derived factor-1, SDF-1)。CXCR4和SDF-1形成CXCR4/SDF-1生物反应轴,在乳腺癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、喉癌、非小细胞肺癌和胰腺癌等多种肿瘤的转移过程中发挥重要的调控作用。 RNA干扰(RNA interference, RNAi)作用机制在于应用小的双链RNA引发序列特异性的基因表达的“沉默”或“敲除”。在哺乳动物细胞中这种双链RNA可以是短发夹结构RNA (Small hairpin RNA,shRNA);也可以是3'-端带有游离碱基的简单的二聚体(Small interference RNA, siRNA)。转染合成的siRNA所得到的靶基因抑制效果往往时间比较短,而且局限于容易转染的细胞系。与siRNA相比,应用shRNA获得长期稳定的基因干扰更为有效。最近,已有研究报道应用siRNA沉默乳腺癌中CXCR4。 至今为止,尚未见CXCR4/SDF-1生物反应轴对人涎腺粘液表皮样癌增殖和转移有调控作用的相关报道。我们推测CXCR4也可能涎腺粘液表皮样癌增殖和转移有关。在本研究中我们选择了同一来源的两种不同增殖和转移能力的涎腺粘液表皮样癌细胞系,MEC-1细胞系和其高转移分离株Mc3细胞系,检测了两种细胞系CXCR4的差异表达以及SDF-1α的表达情况,成功构建CXCR4-shRNA表达载体,稳定转染Mc3细胞,阻断其CXCR4的表达。并通过一系列体外、体内试验检测Mc3细胞增殖、转移生物学特性,探讨CXCR4对人涎腺粘液表皮样癌可能存在的生物学效应。主要研究方法和结果包括以下几个方面: 1. CXCR4在人涎腺粘液表皮样癌高低转移细胞系中的表达 人类基因组分类芯片(BioStarH-I)筛选MEC-1细胞及Mc3细胞差异表达基因,选定靶基因CXCR4,用RT-PCR、免疫细胞化学和流式细胞术进一步检测CXCR4在MEC-1细胞和Mc3细胞中的差异表达。结果显示CXCR4在Mc3细胞中高表达,而在两种细胞中均发现SDF-1α的表达,二者无显著性差异。 2. CXCR4-shRNA真核表达载体的构建及鉴定 按照siRNA设计原则,设计针对CXCR4基因的shRNA,构建pWH1- CXCR4真核表达载体,应用Lipofectamine 2000转染Mc3细胞,600μg/ml G418筛选3周,300μg/ml G418继续筛选1周。用RT-PCR、免疫细胞化学和流式细胞术证实稳定转染CXCR4-shRNA后CXCR4 mRNA和蛋白的表达水平被显著抑制。 3. CXCR4-shRNA抑制Mc3细胞增殖相关特性 细胞生长曲线测定、软琼脂克隆形成试验、细胞周期检测、裸鼠颌下腺原位移植瘤等方法,发现转染CXCR4-shRNA的Mc3细胞体外和裸鼠体内生长受到抑制。实验组、空载体组、对照组细胞群体倍增时间分别为26.5 hr,20.6hr和20.4 hr。CXCR4-shRNA转染对Mc3细胞软琼脂克隆形成抑制率为33.9%;流式细胞仪结果显示转染CXCR4-shRNA的Mc3细胞S期和G2期细胞比例下降;裸鼠颌下腺原位移植瘤抑制率为17.1%。 4. CXCR4-shRNA抑制Mc3细胞侵袭和转移相关特性 转染CXCR4-shRNA的Mc3细胞在Matrigel人工重构基底膜上30 min的粘附抑制率21.4%;趋化率和侵袭率分别降低至对照组的43.8%和52.7%;裸鼠肺结节转移抑制率为47.6%。 5. CXCR4-shRNA对Mc3细胞VEGF蛋白表达的影响 免疫组化结果显示转染CXCR4-shRNA的Mc3细胞VEGF蛋白的表达显著降低。 结论: 1. CXCR4在人涎腺粘液表皮样癌高转移细胞系Mc3中高表达。 2. CXCR4基因沉默可导致Mc3细胞增殖能力、体外迁移和侵袭能力降低,并能有效抑制Mc3细胞的肺转移,提示CXCR4与Mc3细胞的增殖及高转移性有关。 3. CXCR4可以调控Mc3细胞血管VEGF的表达,提示可能调控该肿瘤的血管生成和微循环的建立。 4. CXCR4有可能作为涎腺粘液表皮样癌的恶性度和转移性的表型;预后评估的参考;也可能成为其治疗的靶基因。
【学位单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位年份】:2008
【中图分类】:R739.8
【部分图文】:

趋化因子受体,空间构型,结构特征


SDF-1 空间构型图1. 2 趋化因子受体 4 的结构特征CXCR4 为 SDF-1 受体,高度保守,α 螺旋跨膜 7 次,由酸组成,在人体内,编码基因位于人染色体 2q21,有一个胞个胞内环,3 个胞外环和 1 个胞内 C 端,SDF-1 与 CXCR4 的并与 CXCR4 和第二胞外环 ECL2 (second extracelluar loop) 相启动下游信号通路。

电泳图,电泳,阳性率,细胞


图 1.5 SDF-1α RT-PCR 电泳结果图 1.4 CXCR4 RT-PCR 产物电泳结果* DL2000 (由上至下): 2000bp; 1000bp; 750bp; 500bp; 250bp; 100bp;以下同。3.2 流式细胞术检测 MEC-1,Mc3 细胞系中 CXCR4 蛋白的表达应用 ELITE ESP 型流式细胞仪对阴性对照、MEC-1、Mc3 三组荧光值进行检测,每组检测 5000 个细胞,结果显示阴性对照组 CX阳性率为 1.5%、MEC-1 细胞 CXCR4 阳性率为 2.3%,而 Mc3 细胞 CX的阳性率达 10.0%。CXCR4 膜蛋白在 Mc3 细胞中的表达显著高于MEC-1 细胞中的表达(P <0.01,Pearson Chi-Square test),见图 1

电泳图,电泳,产物,阳性率


图 1.5 SDF-1α RT-PCR 电泳结果图 1.4 CXCR4 RT-PCR 产物电泳结果* DL2000 (由上至下): 2000bp; 1000bp; 750bp; 500bp; 250bp; 100bp;以下同。3.2 流式细胞术检测 MEC-1,Mc3 细胞系中 CXCR4 蛋白的表达应用 ELITE ESP 型流式细胞仪对阴性对照、MEC-1、Mc3 三组荧光值进行检测,每组检测 5000 个细胞,结果显示阴性对照组 CX阳性率为 1.5%、MEC-1 细胞 CXCR4 阳性率为 2.3%,而 Mc3 细胞 CX的阳性率达 10.0%。CXCR4 膜蛋白在 Mc3 细胞中的表达显著高于MEC-1 细胞中的表达(P <0.01,Pearson Chi-Square test),见图 1
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本文编号:2882969

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