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牙周膜中成纤维细胞雌激素受体的表达及雌激素对细胞骨分化能力影响的研究

发布时间:2020-11-14 13:54
   绝经后妇女骨质疏松发展迅速,与机体雌激素缺乏有关。研究表明雌激素在骨吸收与改建中发挥了极其重要的作用,雌激素缺乏可以引起全身骨质疏松。牙槽骨是机体骨质密度较低的骨组织,最容易出现骨质疏松,临床上主要表现为牙槽骨吸收,导致牙齿松动与脱落,直接影响患者牙齿与牙周组织健康与口腔治疗,但至今对牙槽骨吸收与改建的机理并不十分明确。牙槽骨骨质疏松及吸收是否受雌激素缺乏的影响,目前的报道尚有争论,使得研究骨质疏松状况下牙周组织的生理、病理特点成为涉及牙周病学、牙槽外科、牙齿种植、口腔修复及正畸治疗等口腔多学科的临床问题,也是本研究所关注的问题。 人牙周膜中的成纤维细胞( Human Periodontal Ligament Fibroblast,HPLF)是最主要的细胞成分,牙周膜成纤维细胞通过增殖、分化、分泌基质参与到牙周组织的改建中,在维持牙周组织完整性以及行使牙周改建的功能中发挥重要的作用,而雌激素在其中发挥的作用是我们关心的问题。国内外学者的研究提供了雌激素对HPLF增殖、分化影响的一些线索,如雌激素作用下牙周膜成纤维细胞可以表现出一定的成骨特性,例如分泌骨相关蛋白,以及形成矿化结节等,但其作用途径尚未阐明。 雌激素受体(estrogen receptor,ER)是雌激素的细胞内结合位点,是雌激素发挥作用的关键所在。在机体其他组织和器官,雌激素通常是通过与其特异性受体结合发挥调控细胞生长、增殖和分化的。ER的两种亚型ERα和ERβ已经成功分离出来,在不同的组织中有不同的表达型。目前国内外关于ER与牙周组织关系方面的研究较少。 雌激素可能能够影响牙周膜成纤维细胞的一些生物学特性,例如蛋白合成和细胞生长,也可能对成纤维细胞成骨分化有一定影响,通过本研究我们希望进一步探讨雌激素对牙周改建的生理作用,为临床正畸治疗和牙周病的治疗提供一定的实验依据。 我们通过(1)切除SD大鼠两侧卵巢(OVX),建立人工模拟绝经后的动物模型,观察大鼠牙槽骨高度(临床附着丧失)和血清雌激素水平的关系;(2)取大鼠下颌磨牙区组织,制备冰冻切片后,用免疫组织化学SABC法进行牙周组织ERα、ERβ染色,计数随机区域中阳性细胞个数并进行统计学分析。(3)取因正畸原因拔除的第一前磨牙牙周膜组织,用组织块结合酶消化法培养牙周膜成纤维细胞,制作细胞爬片,免疫细胞化学进行ERα、ERβ染色,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测ER的mRNA的表达,Western blot法分析ER蛋白的表达;(4)对体外培养的牙周膜成纤维细胞给与不同生理浓度的雌激素刺激,以3H-胸腺嘧啶和3H-脯氨酸参入实验确定细胞DNA和胶原合成产物的变化,明确雌激素对细胞增殖的影响;(5)在不同生理浓度的雌激素刺激下,测定细胞碱性磷酸酶活性(ALP)和骨钙素(OCN)含量,明确雌激素对细胞骨分化能力的影响。 研究结果发现: (1)去势组大鼠下颌第二磨牙区可见牙槽骨皮质变薄,骨小梁变稀疏,排列紊乱,骨髓腔隙增大,骨小梁表面成骨细胞及破骨细胞均有增加。牙周膜水肿、疏松,排列不规则,血管扩张充血,牙骨质密度也有减低,较假手术组明显呈退行性变,临床附着水平也与假手术组有统计学差异(P0.01),而雌激素治疗组可改善这一病理变化。这与动物血清雌激素浓度有明显的相关性。 (2)大鼠牙周膜组织切片中,可见ER阳性染色的棕黄色颗粒,PBS空白对照组则无棕黄色染色,阳性对照可见强阳性染色。观察发现ERα、ERβ在SD大鼠牙周组织中比较广泛的表达,ER在细胞胞核和胞浆均有表达,ERβ的阳性率明显高于ERα。 (3)体外培养人牙周膜成纤维细胞制备细胞爬片,通过免疫细胞化学方法可观测到ERα、ERβ在胞核中表达。 (4)通过RT-PCR检测ERmRNA,各组细胞用雌激素受体的特异性引物均获得了目的PCR产物,分别对应ERα、ERβ的特异条带 (5)同株细胞经Western blot检测结果,各组细胞可见正确分子量的蛋白印迹条带,其中ERβ的条带较ERα对应的蛋白条带浓。 (6)以10-7, 10-8和10-9mol/L浓度的E2作用于细胞,与阴性对照和空白对照组相比,各种浓度的雌激素均未增加细胞DNA的合成量和胶原合成(P0.05) (7)体外培养牙周膜成纤维细胞用浓度为10-7、10-8、10-9mol/L的E2分别处理,与空白对照组相比,E2浓度依赖地增加细胞内ALP活性和OCN的含量,受体特异性阻断剂ICI182780可以阻断这一效应。 根据以上研究结果,得出以下结论: (1)雌激素缺乏时动物牙槽嵴高度降低,骨量减少,附着丧失增加,而给予去势后大鼠补充雌激素,牙槽骨的骨密度增加,附着丧失减轻,表明雌激素对于改善骨质疏松具有一定作用。 (2)大鼠牙周膜中,可观察到ER免疫组化阳性的细胞,结合细胞分布特点,可以得出成纤维细胞中有雌激素受体表达的结论。说明牙周组织对雌激素有直接应答反应。ERα和ERβ阳性率分别为20%和40%左右,二者间有显著性差异(P0.05),说明在大鼠的牙周膜以ERβ的表达为主。 (3)体外培养的人牙周膜成纤维细胞中也可观察到ER两种亚型的表达。RT-PCR法和Western blot法分别从mRNA水平和蛋白水平证实了ERα、ERβ在HPLF上均有表达。提示雌激素在HPLF的增殖、分化中发挥作用很可能是通过配体—受体途径实现的 (4)生理浓度的雌激素对牙周膜成纤维细胞的胶原和DNA合成没有影响,说明雌激素-受体复合体作用的基因可能与细胞的增殖和胶原合成无关。 (5)生理浓度的雌激素能促进牙周膜成纤维细胞合成和释放细胞成骨分化的指标ALP和OCN,说明雌激素能够促进牙周膜成纤维细胞向成骨方向分化,这对于维持牙周组织正常的改建和损伤后的修复有重要的意义。
【学位单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位年份】:2007
【中图分类】:R781.4;R580
【部分图文】:

牙周膜中成纤维细胞雌激素受体的表达及雌激素对细胞骨分化能力影响的研究


aERα染色结果(×200倍)

牙周膜中成纤维细胞雌激素受体的表达及雌激素对细胞骨分化能力影响的研究


bERβ染色结果(×200倍)

睾丸切片,色结,阳性对照


睾丸切片阳性对照染色结果(×200倍)
【引证文献】

相关硕士学位论文 前1条

1 蔡川;雌激素受体相关受体α在牙周膜细胞中的表达及调控的初步研究[D];第四军医大学;2010年



本文编号:2883546

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