Caspase-3，8，9在莱菔硫烷诱导人腺样囊性癌细胞系ACC-M凋亡中的作用

发布时间：2020-11-15 00:25

　　 目的：涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma, SACC）是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一，其发病率居涎腺恶性肿瘤的第二位。嗜神经浸润性和易发生血行性转移是涎腺腺样囊性癌的主要特征。其发病机制目前尚不完全清楚，因此有必要以调控细胞周期，诱导细胞凋亡为靶点研究肿瘤细胞凋亡的机制，探索新的治疗方法，提高患者的生存质量和生存率。Caspase的全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，在细胞凋亡过程中起至关重要的作用。莱菔硫烷（sulforaphane，SFN）是从十字花科类植物中提取的一种异硫氰酸酯，因其抗肿瘤效果佳而受到广泛关注。Caspase家族成员在肿瘤，缺血再灌注，炎症，组织损伤等过程中参与了多种细胞的凋亡，Caspase是细胞凋亡的中心环节。我们近期的研究表明，SFN可以抑制腺样囊性癌细胞系ACC-M的增殖，并诱导其凋亡。但是在SFN诱导ACC-M细胞凋亡的过程中，Caspase-3,8,9所起的作用，国内外尚未见报道。本实验拟对体外培养的人腺样囊性癌ACC-M细胞经40μM SFN处理后，采用分光光度法检测Caspase-3,8,9在不同时间点的活性的变化。并且采用流式细胞术检测经Caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理后，SFN诱导ACC-M细胞凋亡情况，从而研究Caspase-3,8,9在SFN诱导ACC-M细胞凋亡过程中的作用，探讨其可能的机制，并为临床上治疗涎腺腺样囊性癌提供理论依据。 材料和方法： 1材料 ACC-M：上海交通大学口腔颌面外科实验室提供，建立于1995年；Caspase-3,8,9活性检测试剂盒及广谱Caspase抑制剂Z-VAD-FMK：购自碧云天生物技术研究所； SFN：购自美国LKT实验室，纯度≥98%；细胞凋亡试剂盒（Annexin-V-FITC/PI试剂盒）：购自北京宝赛生物技术有限公司。 2方法 2.1药液配制 SFN：用DMSO配制成100μM储存液，-20℃冰箱储存。使用前用RPMI1640培养液稀释。 Caspase抑制剂Z-VAD-FMK的配制：将20μL Caspase抑制剂Z-VAD-FMK（20mM）放入4mL DMSO溶液中，配成100μM储存液混匀后适当分装备用。 2.2细胞培养：采用加入10%胎牛血清和青霉素（100U/mL）、链霉素（100μg/mL）的RPMI1640培养基，在37℃、5%CO2恒温箱内饱和湿度下培养，当细胞爬满瓶底壁的80%时以0.04％EDTA和0.25%胰蛋白酶（1:1）混合液消化传代。 2.3分光光度法检测Caspase-3,8,9活性：先利用pNA标准品制作出pNA浓度相当于A405的标准曲线。取对数生长期细胞制成2.0×105/mL细胞悬液接种于6孔板，继续培养24h后，弃去培养液，每孔加入浓度为40μM的SFN2mL。继续培养0h（对照组）、4h、8h、16h和24h，收集细胞后以PBS洗涤一次，吸尽上清液，按照每20×105个细胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解，离心后收集上清，即为待测样本。分别将10μL待测样本，80μL检测缓冲液，10μLAc-DEVD-pNA（或Ac-IETD-pNA或Ac-LEHD-pNA）置于96孔板中，并设空白对照。将96孔板置于酶标仪上测定A405，通过与A405标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。然后分别绘制以时间为横轴，pNA的量为纵轴的Caspase-3,8,9活性图。 2.4流式细胞术检测：实验分三组，先用最终浓度为50μM的Caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理细胞2h，再用40μMSFN处理细胞24小时作为实验组（SFN+Caspase抑制剂组）。以0.04%DMSO处理细胞24小时作为阴性对照组（DMSO组）。以40μMSFN处理细胞24小时作为阳性对照（SFN组）。获取细胞后，Annexin-V-FITC和PI双标记活细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 3统计学分析 以上实验均重复三遍，使用SPSS13.0统计学软件，应用单因素方差分析对pNA含量和细胞凋亡率进行统计学分析。 结果： 1分光光度法检测Caspase-3活性：在SFN诱导ACC-M细胞凋亡过程中，Caspase-3的活性有明显升高，在16小时达到高峰，之后有所下降。经统计学分析，各时间组与空白对照组（0h）相比，均有显著性差异（0h vs4h:P0.01;0h vs8h: P0.01;0h vs16h: P0.001;0h vs24h: P0.01），各时间处理组之间比较，4h,8h,24h组之间两两比较，无统计学差异，P0.05。4h,8h,24h组分别与16h组比较，有统计学差异，P0.05。 2分光光度法检测Caspase-8活性：在SFN诱导ACC-M细胞凋亡过程中，Caspase-8的活性有明显升高，在16小时达到高峰，之后有所下降。经统计学分析，各时间组与空白对照组（0h）相比，均有显著性差异（0h vs4h:P0.05;0h vs8h: P0.01;0h vs16h: P0.001;0h vs24h: P0.01），各时间处理组之间比较，4h,8h,24h组之间两两比较，无统计学差异，P0.05。4h,8h,24h组分别与16h组比较，有统计学差异，P0.001。 3分光光度法检测Caspase-9活性：在SFN诱导ACC-M细胞凋亡过程中，Caspase-9的活性有明显升高，在16小时达到高峰，之后有所下降。经统计学分析，各时间组与空白对照组（0h）相比，均有显著性差异（0h vs4h:P0.05;0h vs8h: P0.001;0h vs16h: P0.001;0h vs24h: P0.001），各时间处理组之间两两比较，均有统计学差异（4h vs8h: P0.001;4h vs16h:P0.001;4h vs24h: P0.001;8h vs16h: P0.001;8h vs24h: P0.001;16hvs24h: P0.05）。 4流式细胞术检测法：SFN组细胞凋亡明显，DMSO组和SFN+Caspase抑制剂组也有细胞凋亡，但凋亡率低。经统计学分析，SFN组与SFN+Caspase抑制剂组相比，凋亡率有显著差异（P0.01）。DMSO组与SFN+Caspase抑制剂组相比无统计学差异（P＞0.05﹚。 结论： 1SFN诱导涎腺腺样囊性癌ACC-M凋亡过程中，Caspase-3,8,9的活性均在4小时时即出现增高，并持续到24小时，且在16小时时活性最高。 250μMCaspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理细胞2h，能显著抑制SFN诱导的ACC-M细胞凋亡，证明Caspase家族成员在SFN诱导的ACC-M细胞凋亡中起作用。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R739.8
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
材料与方法
结果
附图
附表
讨论
结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢
个人简历

【参考文献】

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本文编号：2884108