IL-21在舍格伦综合征发病过程中的作用机制

发布时间：2020-11-15 18:11

　　 舍格伦综合征是一种可以引起外分泌腺分泌功能障碍的慢性系统性自身免疫疾病。根据临床特征可以分为两种类型：原发性舍格伦综合征和继发性舍格伦综合征。原发性舍格伦综合征特点是干燥性角结膜炎和口干症；继发性舍格伦综合征是原发性的症状伴发其他部位的自身免疫疾病,例如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和硬皮病等。舍格伦综合征的发病率为0.5-3%,女性中多见(是男性患者人数的9倍)。舍格伦综合征的发病机制至今尚不清楚,多种因素与其发病相关,例如内分泌因素、遗传因素、神经系统紊乱等,但最关键的致病因素是免疫系统的异常。 IL-21是一种具有多种功能的I型细胞因子,在淋巴细胞的发育、增殖和分化过程中,尤其在抗体产生和浆细胞成熟过程中发挥关键作用。同时,很多研究也证明IL-21参与了多种自身免疫性疾病的发展过程,例如感染性肠病、风湿性关节炎、糖尿病、系统性红斑狼疮等,所以IL-21也被当做自身免疫性疾病治疗中的一种关键因子和治疗靶位。但IL-21在舍格伦综合征的作用尚不清楚,IL-21在舍格伦综合征发病中的作用和具体机制值得深入研究。 因此,为了搞清IL-21在舍格伦综合征发病过程中的作用及其机制,我们选用了常用的舍格伦综合征模型动物NOD小鼠作为研究对象,通过在NOD小鼠中阻断IL-21信号通路,观察IL-21对NOD小鼠舍格伦综合征样症状的影响,并进一步优化NOD小鼠体内IL-21的干扰手段后,对IL-21在舍格伦综合征发病过程中的具体机制进行深入的研究。 第一部分：在NOD小鼠体内阻断IL-21信号对舍格伦综合征发病的影响 目的：使用融合蛋白IL-21R.Fc竞争性阻断IL-21与IL-21受体的结合,抑制NOD小鼠体内IL-21信号通路,检测NOD小鼠舍格伦综合征症状的变化,从而研究IL-21对舍格伦综合征发病的影响。 方法：利用分子克隆技术以小鼠cDNA为模版分别PCR扩增IL-21受体胞外区片段和小鼠IgG2a的Fc片段,其中Fc片段的235、3]8、320和322为氨基酸进行诱导定点突变,以减少Fc受体结合活性和补体激活能力。然后将IL-21受体胞外区片段和Fc段基因插入质粒pcDNA3.1+构建成融合蛋白IL-21R.Fc的真核表达质粒pcDNA3.1-IL-21R.Fc。(?)勾建好的质粒用脂质体瞬时转染CHO细胞进行表达,收集培养上清和细胞裂解液利用亲和层析法对融合蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE电泳检验。将纯化的融合蛋白IL-21R.Fc通过尾静脉注射作用于NOD小鼠体内,定期检测唾液流速和颌下腺HE染色病理切片,对NOD小鼠的唾液分泌功能和颌下腺炎症浸润情况进行评价。 结果：质粒pcDNA3.1-IL-21R.Fc构建成功,转染CHO细胞后成功表达并纯化得到融合蛋白IL-21R.Fc。通过融合蛋白IL-21R.Fc在NOD小鼠体内对IL-21信号的抑制作用,缓解了NOD小鼠的舍格伦综合征症状。唾液分泌功能障碍的进展减慢,颌下腺中的淋巴细胞浸润也得到了缓解。 结论：IL-21信号在NOD小鼠的舍格伦综合征发病过程中发挥了重要的致病作用。对IL-21信号的阻断和抑制可能作为舍格伦综合征的一种有效治疗手段。 第二部分：在NOD小鼠颌下腺局部抑制IL-21表达对舍格伦综合征的影响机制 目的：使用表达IL-21shRNA的慢病毒表达载体通过颌下腺导管逆行灌注,在NOD小鼠颌下腺中长期抑制IL-21的表达,观察对NOD小鼠舍格伦综合征的影响,并对IL-21的作用机制进行研究分析。 方法：通过IL-21shRNA的慢病毒载体逆行灌注NOD小鼠颌下腺,检查慢病毒对IL-21表达的抑制效果,定期检测唾液流速和颌下腺淋巴浸润情况。利用实时定量PCR对辅助T淋巴细胞相关细胞因子mRNA水平进行检测,研究IL-21抑制对NOD小鼠颌下腺中各种细胞因子的影响。利用流式细胞术和免疫组织化学法对NOD细胞中的CD4+CXCR5+Tfh细胞进行检测,观察IL-21抑制对Tfh细胞的影响。 结果：IL-21shRNA的慢病毒表达载体明显抑制了IL-21在NOD小鼠颌下腺中的表达,并缓解了NOD小鼠的唾液分泌功能障碍和颌下腺淋巴浸润的进展。通过对NOD小鼠颌下腺中多种细胞因子的表达进行的实时定量PCR检测,发现IL-21的抑制对Tfh细胞相关的CXCR5和BCL-6有明显的抑制作用。NOD小鼠颌下腺中CD4+CXCR5+Tfh细胞占CD4+T淋巴细胞的比率在IL-21的表达受到抑制后得到明显降低,免疫组织化学法也发现颌下腺中CXCR5+细胞随着IL-21的抑制而减少。 结论：在NOD小鼠颌下腺中局部抑制IL-21缓解了颌下腺的分泌功能障碍和淋巴细胞浸润的进展,延缓了舍格伦综合征在NOD小鼠颌下腺中的发展。IL-21的抑制主要通过影响Tfh细胞的分化发育,从而影响了生发中心的形成和自身反应性的浆细胞的成熟。 综上所述,本课题证实了IL-21在舍格伦综合征发病过程中的重要致病作用,并且.验证了局部抑制IL-21在治疗舍格伦综合征中的有效性。根据实验数据我们发现IL-21通过影响Tfh细胞的分化发育,影响了颌下腺中生发中心的形成和自身反应性的浆细胞的成熟,从而导致了舍格伦综合征的发展。进一步探索IL-21的干预手段对舍格伦综合征的治疗有着重要的意义。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R781.7
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
符号说明
前言
第一部分 在NOD小鼠体内阻断IL-21信号对舍格伦综合征发病的影响
    材料和方法
    实验结果
    讨论
第二部分 在NOD小鼠颌下腺局部抑制IL-21表达对舍格伦综合征的影响机制
    材料和方法
    实验结果
    讨论
参考文献
致谢
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【参考文献】

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1 袁双龙;蒋莉;张晓莉;李舒帆;段宏梅;王晓非;;原发性干燥综合症患者血清IL-21水平及其临床意义[J];细胞与分子免疫学杂志;2007年02期

2 王晓非;袁双龙;蒋力;张晓莉;李舒帆;郭韵;吴春玲;陈涓涓;;系统性红斑狼疮患者血清BAFF和IL-21的变化及意义[J];细胞与分子免疫学杂志;2007年11期

本文编号：2885050