正畸牙齿移动过程中牙周膜成纤维细胞自噬作用的初步研究

发布时间：2017-04-08 11:04

  本文关键词：正畸牙齿移动过程中牙周膜成纤维细胞自噬作用的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：自噬（Autophagy，来自于希腊语：auto "self"和phagein "to eat"即“自己吃自己”）是细胞内一种基本的分解、死亡机制。在这一过程中，细胞内多余的或者功能失调的成分通过溶酶体被降解[1]。自噬是调节细胞新陈代谢、维持细胞生存的重要机制[2]；而在肿瘤、感染性疾病等病理条件下，自噬功能则表现出了两方面的作用，一方面它是一种适应性反应，为肿瘤细胞的生存提供必需的基础能量，，促进疾病的发展；另一方面自噬的发生可以诱导病变细胞发生程序性死亡，起到阻碍疾病进程的作用[3]。之前的研究结果显示，诸如内质网受压、免疫细胞被激活、氧化应激、感染等许多内源性和外源性因素，均可以诱发细胞自噬水平的变化[2]。 牙周组织的改建、完成及最后的稳定，是正畸治疗过程中牙齿移动和治疗结束后长期保持的基础。而在整个治疗过程中，牙周膜连接牙齿和牙槽骨，在牙周组织的改建过程中起到中间桥梁作用[4]。牙周膜成纤维细胞是牙周膜中主要的细胞成分，当正畸矫治力传递到牙周膜上时，这些细胞能够合成分泌多种细胞因子，参与包括牙周膜自身、牙槽骨、牙骨质等牙周组织的改建[5]。很多研究者认为当正畸矫治力施加到牙齿上后，压力侧的牙周膜出现压缩、宽度变窄的情况，导致其中的毛细血管也随之受到压迫，出现管腔变窄甚至闭塞的现象，这就会导致压力侧牙周膜微循环受阻、局部牙周膜血供减少[6]。局部牙周膜组织中血供的减少，会直接使牙周膜成纤维细胞处于一个低氧、营养缺乏的环境，在这种环境下，牙周膜成纤维细胞处于一种饥饿的环境[7]。那么，这种饥饿环境是否会诱导牙周膜细胞自噬作用加强，造成细胞数量减少呢？这个问题与牙周组织的正畸改建、以及牙根吸收等问题的产生机制直接相关。本研究通过动物实验观察了正畸牙齿移动过程中牙周膜宽度、毛细血管、细胞数量的变化，并进一步通过体外实验研究了饥饿环境下人牙周膜成纤维细胞自噬水平的变化，对这个问题进行了初步的研究。本课题的实验研究内容包括下面两个方面： 1.牙齿移动过程中牙周组织组织形态学变化的动物实验研究 目的：通过建立SD大鼠正畸牙齿移动模型，分析牙齿移动过程中，牙周组织组织形态学的变化，研究牙周膜细胞所处的环境状况。 方法：将SD大鼠随机分为空白对照组、正畸加力1天组、正畸加力3天组、正畸加力7天组。空白对照组SD大鼠口内不放置任何加力装置；正畸加力各组中，建立SD大鼠上颌右侧第一磨牙的正畸牙齿移动模型，用螺旋镍钛拉簧加力30g，牵引SD大鼠上颌右侧第一磨牙向近中移动，分别加力1天、3天、7天；按实验设计的加力时间，取材，制备HE切片，镜下观察牙周组织组织形态学的变化。 结果：大鼠正畸牙齿移动过程中，①牙周膜宽度变化结果显示：空白对照组近远中牙周膜宽度比值为1.012±0.124；正畸加力1天、3天、7天组中，远中牙周膜宽度/近中牙周膜宽度的比值随着加力时间的延长逐渐增大，且均明显高于对照组（P＜0.05），在正畸加力7天组中，远中张力侧与近中压力侧的牙周膜宽度差可达3倍以上（远近中牙周膜宽度比值3.342±0.246）；②压力侧牙周膜内毛细血管变化结果显示：空白对照组近中侧牙周膜内毛细血管数目较多，管腔呈圆形或卵圆形，随着加力时间的延长，正畸加力1天、3天组压力侧牙周膜内毛细血管数目减少，管腔被压缩，而正畸加力7天组压力侧牙周膜内毛细血管数目增多，管腔增宽；③压力侧牙周膜内细胞数目变化结果显示：正畸加力1天、3天组开始近中压力侧牙周膜内细胞数目相对于空白对照组明显减少（P＜0.05），且随着加力时间的延长，这种减少的趋势变得越来越明显。而在正畸加力7天组则出现牙周膜内细胞数目相对于空白对照组明显增多的情况（P＜0.05）。 结论：在正畸矫治力的作用下，压力侧牙周膜内血管数目减少，管径减小，可使局部的牙周膜细胞处于一种缺氧、营养缺乏的环境，进而出现细胞数减少、消亡的情况。 2.饥饿诱导环境下人牙周膜成纤维细胞自噬作用发生情况的实验研究 目的：初步研究饥饿诱导环境下人牙周膜成纤维细胞自噬作用的发生情况。 方法：取体外原代培养的人牙周膜成纤维细胞进行实验，将细胞按随机原则分为正常对照组和实验组。正常对照组细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养；实验组细胞用饥饿诱导方法，分别用厄尔氏平衡盐溶液（Earle，s Balanced SaltSolution，EBSS）培养1h、2h、3h、4h、6h；应用透射电子显微镜观察各组间人牙周膜成纤维细胞中自噬体数目的变化，采用细胞免疫荧光染色和Western blot方法检测人牙周膜成纤维细胞中自噬相关蛋白LC3的表达。 结果：饥饿诱导人牙周膜成纤维细胞后，①透射电镜观察结果显示： EBSS饥饿诱导组人牙周膜成纤维细胞胞浆中自噬体数目增多，其中2h、3h、4h最多；②免疫荧光染色法定性分析结果显示，对照组LC3蛋白表达呈阴性，EBSS饥饿诱导各组人牙周膜成纤维细胞胞浆LC3蛋白表达呈阳性，其中1h、6h组呈弱阳性表达，2h、3h、4h组呈强阳性表达；③Western blot定量分析结果显示：与对照组比较EBSS饥饿诱导各组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大（P＜0.05），EBSS饥饿诱导1h后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值开始升高，4h组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值到达顶峰，6h组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值开始下降。 结论：饥饿诱导环境下可诱导人牙周膜成纤维细胞自噬水平升高。 上述研究结果显示，牙齿在正畸力的作用下，压力侧牙周膜内血管数目减少，管径减小，可使局部的牙周膜细胞处于一种缺氧、营养缺乏的环境，进而出现细胞减少、消亡的情况。而体外细胞学试验显示，在饥饿环境下，出现人牙周膜成纤维细胞胞浆中自噬体数目增多，LC3蛋白表达增高等自噬水平升高的表现，提示这可能是压力侧牙周组织改建过程中牙周膜细胞对矫治力作用的一种适应性表现，同时也可能是压力侧组织细胞减少、消亡的机制之一。
【关键词】：正畸 人牙周膜成纤维细胞 血管 牙周膜 自噬 饥饿
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R783.5
【目录】：

• 缩略语表6-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-27
• 第一部分 正畸治疗过程中的牙周组织改建16-20
• 1.1 牙周组织的改建16-17
• 1.2 牙周膜的改建17-18
• 1.3 牙周膜成纤维细胞18-19
• 1.4 牙周膜血管微循环的变化19
• 1.5 正畸牙齿移动过程中压力侧牙周膜细胞消亡机制19-20
• 第二部分 自噬的研究进展20-27
• 2.1 自噬的基本概念和特征20
• 2.2 自噬的形式20-21
• 2.3 自噬发生的分子机制21-23
• 2.4 LC3 蛋白与自噬的关系23
• 2.5 自噬在生理病理状态下的作用23-25
• 2.6 自噬性细胞死亡25-27
• 实验一 牙齿移动过程中牙周组织组织形态学变化的动物实验研究27-40
• 1 材料27-28
• 1.1 实验动物27-28
• 1.2 主要试剂及设备28
• 2 实验方法28-32
• 2.1 SD 大鼠正畸牙齿移动模型28-29
• 2.2 实验分组29
• 2.3 组织取材、固定29-30
• 2.4 SD 大鼠正畸牙齿移动过程中牙周组织组织形态学观察30-31
• 2.5 SD 大鼠正畸牙齿移动过程中牙周膜间隙宽度变化的研究31-32
• 2.6 SD 大鼠正畸牙齿移动过程中压力侧牙周膜中细胞数量的计数方法32
• 2.7 统计学分析32
• 3 结果32-36
• 3.1 大鼠正畸牙齿移动模型32-33
• 3.2 大鼠正畸牙齿移动过程中牙周组织组织形态 HE 染色观察结果33-36
• 4 讨论36-40
• 4.1 关于本研究中正畸牙齿移动动物模型的建立36-37
• 4.2 关于大鼠正畸牙齿移动过程中牙周膜间隙宽度的变化37-38
• 4.3 关于大鼠正畸牙齿移动过程中压力侧牙周膜内毛细血管的变化38
• 4.4 关于大鼠正畸牙齿移动过程中压力侧牙周膜内细胞数量的变化38-39
• 4.5 小结39-40
• 实验二 饥饿诱导环境下人牙周膜成纤维细胞自噬作用发生情况的实验研究40-53
• 1 材料41-42
• 1.1 主要仪器及设备41
• 1.2 主要试剂41-42
• 2 方法42-47
• 2.1 人牙周膜成纤维细胞的体外原代培养42
• 2.2 抗角蛋白和抗波形蛋白染色法鉴定人牙周膜成纤维细胞的来源42-43
• 2.3 实验分组43
• 2.4 透射电子显微镜观察饥饿诱导人牙周膜成纤维细胞胞浆中自噬体的变化43-44
• 2.5 免疫荧光染色法检测饥饿诱导人牙周膜成纤维细胞中 LC3 的表达44-45
• 2.6 Western blot 检测饥饿诱导人牙周膜成纤维细胞中 LC3 的表达45-47
• 2.7 统计学分析47
• 3 结果47-50
• 3.1 人牙周膜成纤维细胞的原代培养及鉴定47-48
• 3.2 透射电镜观察饥饿诱导人牙周膜成纤维细胞超微结构结果48-49
• 3.3 免疫荧光染色结果49
• 3.4 Western blot 检测结果49-50
• 4 讨论50-53
• 4.1 关于饥饿诱导条件的选择50
• 4.2 关于透射电子显微镜观察饥饿诱导人牙周膜成纤维细胞胞浆中自噬体的变化50-51
• 4.3 关于饥饿诱导人牙周膜成纤维细胞内 LC3 蛋白表达的变化51
• 4.4 小结51-53
• 小结53-55
• 参考文献55-63
• 个人简历和研究成果63-64
• 致谢64-65
• 临床病例报告65-80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 李国东;吴德全;李本义;;细胞自噬在肿瘤中作用的研究进展[J];癌症;2009年04期

2 王海杰;谭玉珍;;细胞自噬研究技术进展及其应用[J];中国细胞生物学学报;2011年07期

3 李小彤,张丁,傅民魁,杨雁琪;机械牵张力对人牙周膜细胞成骨样细胞功能的影响[J];中华口腔医学杂志;2002年02期

4 吕雷;林康;高伟阳;何智灵;高自勉;李浙峰;李俊杰;;饥饿诱导增生性瘢痕成纤维细胞自噬发生[J];中国病理生理杂志;2013年02期

  本文关键词：正畸牙齿移动过程中牙周膜成纤维细胞自噬作用的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：292704