利用BiFC技术研究p12 CDK2AP1 和Upp的相互作用及Upp外源表达对SCC-25细胞的影响
发布时间：2020-12-20 03:32
口腔癌是位居世界第六位的常见癌，组织病理学研究表明其大部分属于鳞状上皮细胞癌。由于发病部位在头颈，病损多表浅，严重影响了患者的生理功能和心理健康。随着分子生物学等领域的不断发展针对肿瘤发病机制、癌基因、抑癌基因的研究成为近年来肿瘤基因治疗的主要研究方向之一。CDK2AP1（cyclin dependent kinase2associated protein1）作为抑癌基因中的一员，越来越被研究者所关注。其调控蛋白p12CDK2AP1也受到广泛关注。研究发现p12CDK2AP1蛋白负性调节CDK2（cyclin dependentkinase2）的活性从而达到抑制DNA复制的作用，其在头颈部鳞状细胞癌中低表达或缺失表达，说明p12CDK2AP1蛋白可能在口腔鳞癌的发生发展中起一定的作用。2009年我们利用酵母双杂交筛选出了p12CDK2AP1蛋白的新的结合作用蛋白Upp（unnamed proteinproduct），被定位于人类4号染色体，与致死因子4，MORF4（mortal...
【文章来源】：中国人民解放军空军军医大学陕西省 211工程院校
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
酵母双杂交技术原理示意图
?妒垦?宦畚?16-图 2 荧光共振能量转移技术原理示意图2.2 荧光共振能量转移(FRET)技术的特点显微成像技术和 FRET 的联用，使蛋白质相互作用的研究更准确，实时[89]。但FRET 技术仍存在难以解决的难题：(1)自发荧光的细胞，供体和受体发射光谱有重叠，同时被激发等。(2)FRET 技术对设备要求较高。(3)FRET 数据处理较为繁琐。3 生物发光共振能量转移(BRET)技术3.1 生物发光共振能量转移(BRET)技术原理生物发光共振能量转移 BRET(Bioluminescence resonance energy transfer)技术的能量转移原理和 FRET 相同[90, 91]。BRET 是将某些海生动物体内天然的荧光素酶作为能量供体，和相应底物的作用才能激发出荧光，能量受体是一个荧光蛋白，当供体荧光素酶的激发光和受体荧光蛋白的吸收光光谱有重叠时，能发生能量转移现象。在蛋白质相互作用的研究中，需将一个蛋白与能量供体融合，另一蛋白与能量受体融合，如果两蛋白质之间没有相互作用，只能检测到能量供体氧化底物后发出的光。当两蛋白质之间有相互作用时，由于两蛋白在空间上相互靠近，使能量供受体之间的距离靠近，当供受体距离小于 10nm 时，会发生能量转移，受体会发光，可检测到其光信号[92]。3.2 生物发光共振能量转移(BRET)技术的特点BRET 最大的优势是能在活细胞内实时、动态的观察蛋白质-蛋白质的相互作用
图 3 双分子荧光互补原理[99]2. 双分子荧光互补技术的提出蛋白质片段互补技术是 BiFC 技术的基础，蛋白质片段互补技术中功能蛋白重新整合，蛋白活性恢复，还需通过特定底物变化来测定蛋白活性的恢复情况，BiFC 技术中断裂荧光片段重新整合成完整的荧光蛋白，利用荧光蛋白的发光特性，自身可以直接作为报告基因，比蛋白质互补技术更加直观方便了[99]。完整的绿色荧光蛋白 GFP(green fluorescent protein，GFP)氨基酸序列常作为荧光标记，1998 年 Abide 等[100]首次尝试了将目的短肽插入到 GFP 的某些氨基酸位点来检测是否能重新发射荧光，以此来筛选合适的插入位点。1999 年 Baird 等[101]在以一次实验中偶然发现在 GFP 的一个突变体的 Y145 位点插入 6 个氨基酸残基(FKTRHN)，GFP 仍能发射荧光，说明外源片段插入 GFP 的某些位点时不会引起其三维结构的变化，也不影响其发色团。他们随即进行了 GFP 的一个循环排列实验，来筛选还有哪些位点可以插入外源片段。Ghosh 等[98]于 2000 年首次报道了 1 个借助反向平行的亮氨酸拉
本文编号：2927129
【文章来源】：中国人民解放军空军军医大学陕西省 211工程院校
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
酵母双杂交技术原理示意图
?妒垦?宦畚?16-图 2 荧光共振能量转移技术原理示意图2.2 荧光共振能量转移(FRET)技术的特点显微成像技术和 FRET 的联用，使蛋白质相互作用的研究更准确，实时[89]。但FRET 技术仍存在难以解决的难题：(1)自发荧光的细胞，供体和受体发射光谱有重叠，同时被激发等。(2)FRET 技术对设备要求较高。(3)FRET 数据处理较为繁琐。3 生物发光共振能量转移(BRET)技术3.1 生物发光共振能量转移(BRET)技术原理生物发光共振能量转移 BRET(Bioluminescence resonance energy transfer)技术的能量转移原理和 FRET 相同[90, 91]。BRET 是将某些海生动物体内天然的荧光素酶作为能量供体，和相应底物的作用才能激发出荧光，能量受体是一个荧光蛋白，当供体荧光素酶的激发光和受体荧光蛋白的吸收光光谱有重叠时，能发生能量转移现象。在蛋白质相互作用的研究中，需将一个蛋白与能量供体融合，另一蛋白与能量受体融合，如果两蛋白质之间没有相互作用，只能检测到能量供体氧化底物后发出的光。当两蛋白质之间有相互作用时，由于两蛋白在空间上相互靠近，使能量供受体之间的距离靠近，当供受体距离小于 10nm 时，会发生能量转移，受体会发光，可检测到其光信号[92]。3.2 生物发光共振能量转移(BRET)技术的特点BRET 最大的优势是能在活细胞内实时、动态的观察蛋白质-蛋白质的相互作用
图 3 双分子荧光互补原理[99]2. 双分子荧光互补技术的提出蛋白质片段互补技术是 BiFC 技术的基础，蛋白质片段互补技术中功能蛋白重新整合，蛋白活性恢复，还需通过特定底物变化来测定蛋白活性的恢复情况，BiFC 技术中断裂荧光片段重新整合成完整的荧光蛋白，利用荧光蛋白的发光特性，自身可以直接作为报告基因，比蛋白质互补技术更加直观方便了[99]。完整的绿色荧光蛋白 GFP(green fluorescent protein，GFP)氨基酸序列常作为荧光标记，1998 年 Abide 等[100]首次尝试了将目的短肽插入到 GFP 的某些氨基酸位点来检测是否能重新发射荧光，以此来筛选合适的插入位点。1999 年 Baird 等[101]在以一次实验中偶然发现在 GFP 的一个突变体的 Y145 位点插入 6 个氨基酸残基(FKTRHN)，GFP 仍能发射荧光，说明外源片段插入 GFP 的某些位点时不会引起其三维结构的变化，也不影响其发色团。他们随即进行了 GFP 的一个循环排列实验，来筛选还有哪些位点可以插入外源片段。Ghosh 等[98]于 2000 年首次报道了 1 个借助反向平行的亮氨酸拉
本文编号：2927129
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/kouq/2927129.html
