真核表达质粒pBK-Fas的构建及转染舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑瘤效应

发布时间：2021-01-02 21:48

　　目的研究Fas基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑制作用,构建Fas基因真核表达质粒pBK-Fas并将其转导入舌鳞癌Tca8113细胞,为舌鳞癌的Fas基因治疗提供实验基础。方法采用RT-PCR反转录成cDNA扩增Fas基因全长,亚克隆到真核表达载体pBK-CMV内,构建出重组真核表达质粒pBK-Fas,酶切鉴定并测序。脂质体法将pBK-Fas转染入Tca8113细胞,RT-PCR检测FasmRNA表达及半定量分析,琼脂糖凝胶电泳检测Fas转染细胞凋亡,流式细胞仪检测Fas蛋白表达。通过细胞生长曲线描记和软琼脂集落形成实验研究Fas基因的体外抑瘤效应。结果PCR扩增后的产物在约1008bp处出现明显的特异性条带,重组质粒pBK-Fas经酶切和测序鉴定,表明均含有大小正确的Fas基因片段。经检测Fas基因转染能提高FasmRNA表达水平、Fas蛋白表达强度,以及细胞凋亡指数。Fas基因转染能提高Fas蛋白的表达强度,由转染前的34.01±4.76上升到转染后的55.72±7.33,差异有统计学意义（P<0.01）。Fas转染细胞株在Fas抗体作用下能够有效启动Fas介导的细胞... 

【文章来源】：安徽医科大学学报. 2009年04期 北大核心

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

PCR产物电泳图

癌细胞Tca8113均有Fas表达。转染前和空质粒对照组的FasmRNA表达水平较低,转染后表达明显升高,见图2。检测12组未转染和重组质粒PBK-Fas转染组及空质粒对照组细胞RT-PCR电泳图谱的灰度值,未转染组、空质粒对照组及转重组质粒PBK-Fas转染组的Fas表达量(Fas、p-actin条带灰度值比值)分别为0·286±0·003、0·291±0·004和·439·安徽医科大学学报　Acta UniversitatisMedicinalisAnhui　2009 Aug;44(4)

2.5.1　细胞生长曲线的描记　转染组Tca8113细胞与未转染组细胞接种培养后通过直接记数法描计Fas转染前后细胞的生长曲线如图4所示。未转染的Tca8113细胞群体倍增时间为0·8 d,对数生长期在3~7 d。而转染的Tca8113细胞群体倍增时间为2 d,对数生长期在4~8 d,最大细胞数为2·6×105,明显低于非转染组细胞,说明Tca8113细胞的生长速率低于对照组未转染Tca8113细胞。表1　转染前后Fas蛋白质表达的流式细胞检测(n=12,-x±s)组　别Fas蛋白阳性率(% ) Fas蛋白阳性强度空质粒对照90. 87±5. 76 34. 05±5. 26未转染组Tca8113 92. 02±5. 47 34. 01±4. 76PBK-Fas转染组Tca8113 95. 08±7. 86 55. 72±7. 33图4　转染前后Tca8113细胞生长曲线2.5.2　MTT法检测细胞增殖抑制率　在MTT法定量检测中,对数生长期的未转染和转染Tca8l13细胞48 h经检测与对照组相比具有不同程度的差异性

【参考文献】：
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本文编号：2953703