NF-κB抑制剂PDTC对人牙髓干细胞定向分化影响及其分子机制的研究

发布时间：2017-04-09 14:21

  本文关键词：NF-κB抑制剂PDTC对人牙髓干细胞定向分化影响及其分子机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：龋病是被WHO列为当代危害人类健康非传染性疾病之一。牙龋坏后,牙本质小管内细菌可导致牙髓组织感染或者发炎。此时牙髓组织中的可分化为成牙本质细胞,成骨细胞,神经细胞的多能干细胞--牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)迁移分化成为有功能的成牙本质样细胞(odontoblast-like cells,OBLCs),保护牙髓。研究表明,NF-κB信号通路在调节干细胞分化方面有重要作用,如炎症因子TNF、IL-17作用于骨髓间充质干细胞激活IKK-NF-κB信号通路促进降解β-catenin,进而促进骨髓间充质干细胞成骨分化[1];在牙髓干细胞分化方面,我们前期研究证明炎症微环境下通过TLR4/My D88/NF-кB信号通路促进炎症因子表达,PDTC作为NF-κB通路抑制剂,能够抑制NF-κB参与炎症环境下对干细胞分化的调控作用,减轻炎症反应[2]。吡咯烷二硫基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)是一种稳定的化合物,氨基甲酸盐的一种,并且被广泛用作NF-κB通路的抑制剂,文献报道,PDTC在干细胞分化中发挥重要作用,如体外大鼠骨髓间充质干细胞在LPS刺激下,激活NF-κB信号通路,RT-PCR检测得出炎症环境下即LPS处理后的骨髓间充质干细胞抗炎因子IL-10和TGF-β3表达升高,当PDTC作用于大鼠间充质干细胞后,抗炎因子的表达受到抑制,表明PDTC参与炎症环境下细胞的免疫调节[3];PDTC阻断NF-κB通路后下调Smad信号通路可以促进系统性红斑狼疮患者的骨髓间充质干细胞的成骨分化[4];而在脂肪间充质干细胞中,PDTC抑制NF-κB通路促进TAZ的表达来抑制脂肪间充质干细胞的成骨向分化[5]。那么PDTC对炎症状态下牙髓干细胞分化是否有积极影响以及作用机制还不清楚。本研究通过体内、体外实验研究NF-κB抑制剂PDTC对牙髓干细胞成牙/成骨分化能力的影响,以探讨PDTC在牙髓干细胞分化中的作用,对牙髓损伤修复时h DPSCs定向分化机制有重要意义。主要的研究结果如下:1.h DPSCs分离、培养和鉴定我们使用组织块酶消化方法,成功分离培养人牙髓原代细胞,然后应用有限稀释法,分离培养牙髓干细胞,取三代细胞运用流式细胞仪进行细胞表面抗原检测和鉴定,并且体外分别矿化诱导2周、成脂诱导3周对细胞多向分化能力进行检测,实验结果表明我们分离并培养的牙髓干细胞符合间充质干细胞相应的分子生物学特点,证明成功建立了h DPSCs细胞系。2.PDTC对h DPSCs增殖能力的影响配制不同浓度PDTC刺激液,通过MTT实验检测不同浓度PDTC刺激液(2-200μmol/L)对h DPSCs增殖能力的影响。结果表明,200μmol/L PDTC可明显抑制该细胞的增殖能力,对h DPSCs有毒性作用,而其余2μmol/L、20μmol/L两组浓度PDTC刺激液与对照组相比,抑制h DPSCs增殖能力,但组间无明显的差异。3.PDTC对体外二维、三维环境培养h DPSCs定向分化的影响首先二维培养环境下用2μmol/L、20μmol/L PDTC刺激液分别矿化诱导h DPSCs2周,通过茜素红染色及定量实验表明,与对照组相比20μmol/L PDTC组矿化结节表达明显高于对照组,以上证明20μmol/L PDTC能有效地促进h DPSCs的成牙/成骨分化。其次体外将h DPSCs接种于多孔纳米纤维结构明胶复合支架,为h DPSCs提供三维生长环境,然后配制浓度为2μmol/L、20μmol/L PDTC刺激液,对照组为10%FBS培养液,通过MTT测定刺激组和对照组1、3、5、7天490 nm吸光度值,结果表明,2μmol/L、20μmol/L PDTC抑制细胞增殖能力;再次,配制2μmol/L、20μmol/L PDTC刺激液,矿化诱导2周,通过茜素红染色及定量结果与矿化组比较表明20μmol/L PDTC刺激组促进h DPSCs成骨分化,结果证明PDTC促进体外三维培养环境下h DPSCs成牙/成骨分化。4.体内裸鼠实验观察PDTC对h DPSCs定向分化的影响本实验通过将预先用20μmol/L PDTC矿化诱导的h DPSCs接种于纳米明胶支架材料,并观察6周后取材,HE染色、Masson染色、Von Kossa染色、X线平片结果及Micro-CT三维重建及数据分析来观察PDTC对h DPSCs成牙/成骨向分化的影响,结果表明,20μmol/L PDTC促进h DPSCs成牙/成骨向分化。5.研究PDTC对h DPSCs定向分化影响机制通过茜素红染色及定量实验和Western blot技术,初步探讨PDTC调控h DPSCs定向分化机制。结果证明PDTC刺激组和对照组比较p-p65蛋白表达降低,表明NF-κB通路参与h DPSCs成牙/成骨分化调节;ERK通路抑制剂(U0126)明显抑制PDTC诱导h DPSCs矿化结节的形成,MAPK(JNK、p38)抑制剂(SP600125、SB203580)抑制相应通路后,PDTC对h DPSCs成牙/成骨分化作用不受影响,即JNK、p38通路不参与PDTC对h DPSCs成牙/成骨分化。综上所述,本研究通过体外、体内实验证明一定浓度PDTC能够抑制h DPSCs增殖,促进h DPSCs的成牙/成骨向分化,并且进一步研究发现NF-κB负向调节PDTC刺激下h DPSCs成牙/成骨分化,ERK通路正向调节该过程,为进一步阐明h DPSCs定向分化机制奠定坚实理论基础。
【关键词】：PDTC 人牙髓干细胞 成牙/成骨分化
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781.1
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-15
• 文献回顾15-23
• 一、牙髓干细胞研究现状15-17
• 二、NF-κB与干细胞分化17-18
• 三、MAPK与干细胞分化18-19
• 四、PDTC研究现状19-20
• 五、牙再生组织工程相关材料研究报道20-23
• 实验一 人牙髓干细胞分离、培养和鉴定23-31
• 1 材料23-24
• 2 方法24-27
• 3 结果27-30
• 4 讨论30-31
• 实验二 PDTC对人牙髓干细胞增殖能力的影响31-35
• 1 材料31-32
• 2 方法32-33
• 3 结果33-34
• 4 讨论34-35
• 实验三 PDTC对人牙髓干细胞定向分化的影响35-42
• 1 材料35-36
• 2 方法36-37
• 3 结果37-40
• 4 讨论40-42
• 实验四 体内裸鼠实验观察PDTC对人牙髓干细胞定向分化的影响42-51
• 1 材料42-43
• 2 方法43-46
• 3 结果46-48
• 4 讨论48-51
• 实验五 PDTC对人牙髓干细胞定向分化影响的机制研究51-61
• 1 材料51-53
• 2 方法53-55
• 3 结果55-59
• 4 讨论59-61
• 小结61-62
• 参考文献62-72
• 个人简历和研究成果72-73
• 致谢73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 王刚;王海燕;梁宏;吉利宾;;LPS对大鼠骨髓MSC NF-κB p65及抗炎性细胞因子mRNA表达的影响[J];青海医学院学报;2013年03期

2 李琦,于颖彦,朱正纲,刘炳亚,纪玉宝,张轶,陈雪华,林言箴;核转录因子κB抑制剂PDTC对胃癌细胞株增殖和凋亡相关蛋白caspase-3表达影响的实验研究[J];中国癌症杂志;2005年01期

3 王志华;吕海鹏;韩冰;张菁;付蕾;张婧;李丹;张芳;何文喜;;NF-κB信号通路在人牙髓细胞分化中作用的研究[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2013年03期

  本文关键词：NF-κB抑制剂PDTC对人牙髓干细胞定向分化影响及其分子机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：295465