PITX2各亚型在调控人表皮干细胞向成釉质细胞分化的作用

发布时间：2017-04-15 06:02

  本文关键词：PITX2各亚型在调控人表皮干细胞向成釉质细胞分化的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：牙齿是由上皮和间充质细胞相互诱导形成,其发育过程大致分为五个阶段,分别是牙板期、蕾状期、帽状期、钟状期和分泌期,每个发育阶段需要多个信号分子的相互作用和相互诱导。成体牙齿的不可再生性使得牙齿再生的研究工作具有重要的科研价值。牙齿的不可再生性主要体现在成体牙齿损坏后无法自行修复,因此后期工作中也无法用成体牙齿的相关细胞进行牙齿再生研究。而寻找间充质来源的细胞这个问题已经基本得到解决,因此我们的主要工作是找到一种可以替代外胚层来源的牙上皮细胞的干细胞,对于上皮来源的干细胞而言,成体干细胞相较于胚胎干细胞从取材上有相当大的优势。目前已有研究表明,成体干细胞中的人表皮干细胞可以替代外胚层来源牙上皮细胞,人表皮干细胞加入外源蛋白FGF8与具有诱导功能的E13.5小鼠牙胚间充质重组,移植裸鼠肾囊膜下培养20天,能够形成嵌合体牙齿,经鉴定后人表皮干细胞可以向成釉质细胞方向分化,但是成牙成釉率较低,分析其原因可能是由于人表皮干细胞向成釉质细胞分化的一些关键因子的缺少。而PITX2基因在牙胚上皮细胞中强烈表达,是牙上皮的标志性基因之一,参与调控牙胚上皮细胞的分化；而且PITX2基因是FGF8的下游基因。本研究利用慢病毒表达系统在人表皮十细胞中过表达PITX2基因,为提高诱导人表皮十细胞向成釉质细胞分化的效率奠定基础。本研究首先鉴定PITX2三种亚型在人牙上皮中同时表达,分别是PITX2a.PITX2b和PITX2c。其次,以人包皮为材料分离得到人表皮干细胞,并通过免疫组化技术鉴定人表皮干细胞相关表面抗原。然后分别构建PITX2三种亚型的慢病毒载体,几种亚型的慢病毒分别感染人表皮干细胞,为了保证感染效率,筛选有绿色荧光蛋白表达的人表皮干细胞单克隆细胞并扩大培养。将过表达PITX2三种亚型的人表皮干细胞分别与E13.5小鼠牙胚问充质进行重组,移植裸鼠肾囊膜下培养20天后,重组块进行脱水包埋处理后鉴定。利用HE和AZAN以及免疫组化技术鉴定,免疫组化技术检测嵌合体牙齿中DSPP.Ameloblastin.Amelogenin表达情况。结果表明,成牙率和成釉率最高的一组是KSC(PITX2a)+E 13.5Mes重组,成牙率为64.3%,成釉率为88.9%。过表达PITX2a在人表皮干细胞,提高了其向成釉质细胞方向分化效率。而PITX2b和PITX2c对于人表皮干细胞向牙上皮细胞分化作用不大,这也说明PITX2基因中PITX2a这个亚型在调控牙胚上皮细胞的分化起主要作用。综上所述,PITX2a这个亚型可能是定向诱导人表皮干细胞牙向分化的关键因子之一,对牙齿的发育是正调控的作用。该研究结果为牙齿再生的问题提供了相关实验数据支持。
【关键词】：牙齿再生 PITX2a 慢病毒 成釉质细胞分化
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R78
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-6
• 中文文摘6-11
• 绪论11-21
• 一、牙齿早期发育的过程和PITX2基因在人牙齿早期发育中的作用11-13
• 二、牙齿再生研究的概况和人表皮干细胞应用于牙齿再生的研究现状13-16
• 三、外源基因在细胞中表达16-18
• 四、研究目的和意义18-21
• 第一章 材料和方法21-37
• 1.1 材料21-23
• 1.1.1 取材21
• 1.1.2 实验动物21
• 1.1.3 试剂21-22
• 1.1.4 实验设备和仪器22
• 1.1.5 试剂配制22-23
• 1.2 实验方法23-37
• 1.2.1 人表皮干细胞的分离和培养方法23-25
• 1.2.2 慢病毒载体构建、慢病毒的生产和感染人表皮干细胞25-32
• 1.2.3 人表皮干细胞中过表达PITX2及其三亚型成牙成釉统计和嵌合体形态32-37
• 第二章 实验结果37-51
• 2.1 人表皮干细胞的分离、培养和鉴定37-38
• 2.2 慢病毒感染人表皮干细胞38-45
• 2.2.1 慢病毒质粒载体的构建和鉴定38-41
• 2.2.2 慢病毒的生产41-43
• 2.2.3 慢病毒感染人表皮干细胞43-44
• 2.2.4 RT-PCR鉴定慢病毒感染人表皮干细胞中PITX2各亚型的表达44-45
• 2.3 过表达PITX2三亚型诱导人表皮干细胞牙向分化45-51
• 2.3.1 嵌合体成牙成釉率的统计45
• 2.3.2 嵌合体牙齿组织形态观察和相关标志物鉴定45-51
• 第三章 分析和讨论51-59
• 3.1 人表皮干细胞的分离、培养和鉴定51
• 3.2 慢病毒感染人表皮干细胞51-53
• 3.3 过表达PITX2三亚型诱导人表皮干细胞牙向分化53-59
• 第四章 结论59-61
• 附录161-63
• 附录263-69
• 参考文献69-77
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果77-79
• 致谢79-81
• 个人简历81-83

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本文编号：307739