实时荧光定量PCR检测变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株gInR、brpA基因的表达差异

发布时间：2017-04-19 13:18

  本文关键词：实时荧光定量PCR检测变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株gInR、brpA基因的表达差异，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 龋病是目前普遍存在的口腔慢性感染性疾病之一，其主要致龋菌是变形链球菌。在变形链球菌诸多生理特性中，粘附性、产酸性、耐酸性这三个致龋特性发挥着至关重要的作用。氟化物可直接与变形链球菌的H+-ATP酶结合从而抑制其活性，降低细胞膜的质子通透性，提高了细菌的耐酸性，因此临床上氟化物作为一种防龋制剂被广泛应用。但随着临床局部应用氟制剂频率和浓度的增高，引起变形链球菌耐氟菌株的选择性生长，，从而使探究耐氟菌株的耐酸机理成为新的研究方向。与变形链球菌一样，耐氟菌株的致龋性也是主要依靠粘附性、产酸性、耐酸性这三个特性。在变形链球菌中，glnR、brpA为转录调节因子，研究表明：glnR基因的表达参与变形链球菌氮代谢的调节和酸度的调控；brpA基因的表达参与细菌的分裂和细菌生物膜的形成，进而与细菌耐酸性的调控息息相关。本实验研究运用分子生物学技术，通过对不同时间的变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株glnR、brpA基因表达的实时荧光定量检测，比较两菌株的基因表达差异，探讨两菌株表达差异的原因，进一步揭示变形链球菌及其耐氟菌株的耐酸机制，为以后预防和治疗龋病提供新的理论指导。 方法： 1、变形链球菌耐氟菌株UA159的诱导及鉴定将变形链球菌接种于以50ug/ml NaF递加直到1000ug/ml NaF的BHI的固体培养基中获得耐氟菌株，对其进行革兰染色及16S rRNA鉴定。 2、变形链球菌及其耐氟菌株生长曲线的测定将变形链球菌及其耐氟菌株分别接种于BHI液体培养基培养48h，每隔8h测定OD600值，绘制两菌的生长曲线。 3、变形链球菌及其耐氟菌株glnR、brpA基因的实时荧光定量检测分别提取培养24h和48h的变形链球菌及其耐氟菌株的总RNA，用实时荧光定量PCR方法测定基因的表达，应用spss17.0对结果进行数据分析。 结果： 1、在BHI固体培养基中变形链球菌UA159-FR生长良好；革兰染色镜下观察菌落形态为短链球状，形态学符合变形链球菌的描述；应用16S rRNA菌种鉴定技术分析UA159-FR属于变形链球菌的可能性为99%。 2、48h的耐氟菌株及其亲代菌株的glnR、brpA基因表达与24h的基因表达有差异，且48h两基因的表达多于24h基因的表达。 3、24h的耐氟菌株及其亲代菌株的glnR基因表达有明显差异，且后者优于前者；48h的耐氟菌株及其亲代菌株的glnR基因表达有差异，且前者优于后者。 4、24h的耐氟菌株及其亲代菌株的brpA基因表达无差异；48h的耐氟菌株及其亲代菌株的brpA基因表达有差异，且前者优于后者。 结论： 1、体外诱导变形链球菌耐氟菌株UA159-FR成功构建，形态学和基因方法鉴定其仍为变形链球菌。 2、24h为变形链球菌UA159及其耐氟菌株UA159-FR的指数期；48h为变形链球菌UA159及其耐氟菌株UA159-FR的稳定期。 3、在两菌的生长稳定期，耐氟菌株glnR和brpA基因的表达量高于变形链球菌glnR和brpA基因的表达量，表明glnR和brpA基因与耐氟菌株的耐酸性增强有关。
【关键词】：glnR基因 brpA基因 变形链球菌 耐酸性 实时定量PCR
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R780.2
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文缩略词表12-13
• 第1章 引言13-15
• 第2章 实验材料15-18
• 2.1 菌株15
• 2.2 试剂盒15
• 2.3 主要化学试剂及耗材15
• 2.4 主要仪器及设备15-16
• 2.5 常用溶液的配制16-18
• 2.5.1 BHI 培养基16
• 2.5.2 BHI 固体培养基（平板生长用）16
• 2.5.3 TAE 电泳缓冲液（1X）16
• 2.5.4 Agarose 凝胶（2%）16-17
• 2.5.5 DEPC 水17
• 2.5.6 溶菌酶（20mg/ml）17
• 2.5.7 裂解液 RLT（1%）17
• 2.5.8 漂洗液 RW（含无水乙醇）17-18
• 第3章 实验方法18-21
• 3.1 变形链球菌耐氟菌株的体外诱导及鉴定18
• 3.2 绘制变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株生长曲线18
• 3.3 不同时间变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株的培养18-19
• 3.4 Real-Time PCR 鉴定19-21
• 3.4.1 引物序列设计及检测19
• 3.4.2 总 RNA 提取19-20
• 3.4.3 Real-Time PCR 分析20-21
• 第4章 结果21-33
• 4.1 变形链球菌耐氟菌株的成功构建21-22
• 4.2 绘制变形链球菌 UA159 及其耐氟菌株的生长曲线22-23
• 4.3 Real-Time PCR 结果23-33
• 4.3.1 引物序列的鉴定23
• 4.3.2 总 RNA 的提取23-24
• 4.3.3 扩增曲线24-25
• 4.3.4 溶解曲线25-28
• 4.3.5 应用得出数据和相对量计算28-33
• 第5章 讨论33-37
• 第6章 结论37-38
• 参考文献38-43
• 导师简介43-44
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果44-45
• 致谢45

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：316383