LPS对人牙髓干细胞增殖定向分化能力的影响及其相关机制的研究

发布时间：2017-05-11 01:07

  本文关键词：LPS对人牙髓干细胞增殖定向分化能力的影响及其相关机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来随着人们对成体干细胞的研究越来越深入，发现其在组织再生和损伤修复领域发挥着非常重要的作用。牙髓干细胞作为存在于牙髓组织的一种成体干细胞，也是口腔生物学领域的研究热点。它具有很强的增殖能力，在体外经过适当的诱导又能向成骨/成牙、成脂、成神经等方向分化。同时众多的研究也发现移植到体内的牙髓干细胞能够形成牙髓牙本质复合体样结构。因此，牙髓干细胞成功体外分离为构建组织工程牙齿和牙髓损伤修复的研究提供了重大的契机。 细菌内毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌主要的致病因子。研究发现LPS能够与细胞表面特异性受体TLR4结合调控间充质干细胞的分化。而龋病致牙髓损伤时，，脱矿牙本质能释放TGFβl等众多生长因子，促进牙髓干细胞向OBLC分化。而细菌及其毒性产物也会进入牙髓，接触刺激牙髓干细胞，那么细菌及其毒性产物如LPS是否影响牙髓干细胞增殖和定向分化能力？目前尚不清楚。为此，本课题在成功构建牙髓干细胞系的基础上，用LPS对牙髓干细胞进行适当的刺激，旨在探索其对牙髓干细胞增殖分化能力的影响。我们还初步分析了MAPK信号通路在LPS调控的牙髓干细胞分化过程中作用。我们的研究结果如下： 1.牙髓干细胞的分离、培养和鉴定 我们通过酶消化组织块法分离培养原代细胞，采用有限稀释法对得到的原代细胞进行纯化，获得相对较为纯化均一的牙髓干细胞系。然后，我们采用了一系列针对干细胞生物学特性的方法对获得的干细胞进行了鉴定。通过流式细胞仪对细胞的表型进行分析，同时对细胞多向分化能力的进行了检测，结果均符合公认的DPSCs的生物学特征，证明我们已经成功的构建了hDPSCs细胞系。 2. LPS对人牙髓干细胞增殖能力的影响 我们通过LPS刺激二维平面和三维立体培养的牙髓干细胞检测其对hDPSCs增殖能力的影响。不同浓度的LPS（0.01-10ug/ml）刺激二维平面培养的牙髓干细胞，MTT检测结果显示LPS在短时间的培养时间（1-5d）内对hDPSCs的增殖能力影响不大，7d时与无刺激因素的对照组相比，各刺激组均出现抑制的现象；而用1ug/mlLPS刺激复合在HA/TCP支架材料上三维立体培养的hDPSCs，电镜观察发现7d组与3d组比较细胞数目明显增多；而3d、7d分别将对照组与LPS刺激组相比细胞数目无显著差异，14d时LPS刺激组较对照组相比细胞数目明显减少。提示LPS长期刺激牙髓干细胞可能会抑制其增殖能力。 3. LPS对人牙髓干细胞定向分化能力的影响 首先，我们通过实时定量PCR检测在牙髓干细胞分化过程中TLR4及相关矿化基因表达情况，发现TLR4在牙髓干细胞表面表达，而且牙髓干细胞分化7天时表达达到最高峰，提示LPS特异性受体TLR4很可能在牙髓干细胞分化早期发挥重要作用。矿化基因DSPP、DMP1、ALP、 OPN在牙髓干细胞在分化过程中均有不同程度的升高。随后，我们分别通过实时定量PCR和茜素红染色分别检测LPS在牙髓干细胞分化过程中对矿化相关基因表达和矿化结节形成情况的影响，结果显示LPS能够显著的促进矿化相关基因DSPP、DMP1、ALP、 OPN的表达；同时LPS刺激也能促进牙髓干细胞矿化结节的形成。我们又通过电镜观察LPS对三维培养的牙髓干细胞胞外基质分泌情况的影响，发现LPS刺激能够促进牙髓干细胞分泌胞外基质及胶原纤维样结构的形成。以上结果证实LPS能够促进牙髓干细胞的定向分化为成牙本质样细胞。以上研究结果与体内牙髓损伤修复的过程类似，该部分的研究为探明牙髓损伤修复的机制提供了可靠的体外研究模型。 4. MAPK信号通路在LPS调控的人牙髓干细胞定向分化过程中作用的研究 为了探索牙髓损伤修复的分子机制，我们对MAPK信号通路在LPS调控的牙髓干细胞定向分化过程的作用也进行了初步的分析。通过茜素红矿化结节染色和实时定量PCR分析，我们发现同时阻断ERK1/2和p38MAPK信号通路后，LPS调控的牙髓干细胞矿化结节和矿化基因表达均发生明显的降低，而阻断JNK对两者的影响却不是很显著。另外，Westernblot检测结果也显示LPS能够活化p38、ERK1/2激酶，且酶的活性随着LPS作用时间的延长而明显增强。说明ERK1/2和p38MAPK信号通路参与了LPS对牙髓干细胞的定向分化过程的调控，并在其中发挥着正向调控的作用，而JNK信号通路可能不参与其中。这为探索牙髓损伤修复的机制研究奠定了一定的基础。 综上所述，LPS对牙髓干细胞的增殖能力和定向分化能力均有不同程度的影响，进一步研究发现ERK1/2和p38MAPK信号通路参与LPS调控的牙髓干细胞分化过程，并在其中发挥着正向调控的作用。本项研究为牙髓损伤修复机制的研究提供了一定的基础，也为临床活髓保存治疗提供了一定的思路。
【关键词】：牙髓干细胞 LPS 增殖 定向分化 MAPKs信号通路
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R781.3
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-21
• 实验一 人牙髓干细胞的分离培养和鉴定21-27
• 1 材料21-22
• 1.1 主要试剂21
• 1.2 主要仪器设备21-22
• 2 方法22-24
• 2.1 人牙髓干细胞培养22-23
• 2.2 牙髓干细胞鉴定23-24
• 3 结果24-25
• 4 讨论25-27
• 实验二 LPS 对人牙髓干细胞增殖能力的影响27-32
• 1 材料27-28
• 1.1 主要试剂27
• 1.2 主要仪器27-28
• 2 方法28-29
• 2.1 不同浓度 LPS 对二维培养的 hDPSCs 体外增殖能力的影响28
• 2.2 电镜观察 LPS 对三维培养的 hDPSCs 体外增殖能力的影响28-29
• 3 结果29-30
• 4 讨论30-32
• 实验三 LPS 对人牙髓干细胞定向分化能力的影响32-42
• 1 材料32-33
• 1.1 主要试剂32
• 1.2 主要仪器32-33
• 2 方法33-37
• 2.1 在牙髓干细胞分化过程中 TLR4 及相关矿化基因 DSPP、DMP1、OPN、ALP mRNA 表达情况33-36
• 2.2 LPS 在牙髓干细胞定向分化过程中作用36-37
• 2.3 统计学分析37
• 3 结果37-38
• 4 讨论38-42
• 实验四 MAPK 信号通路在 LPS 调控的人牙髓干细胞定向分化中作用的研究42-48
• 1. 材料42-43
• 1.1 主要试剂42-43
• 1.2 主要设备43
• 2. 方法43-45
• 2.1 牙髓干细胞的培养43
• 2.2 MAPK 信号通路抑制剂对 LPS 调控的牙髓干细胞定向分化能力的影响43-44
• 2.2.1 茜素红染色分析43
• 2.2.2 矿化相关基因 DSPP、DMP1、ALP、OPN mRNA 水平检测43-44
• 2.3 Western blot 检测 LPS 刺激 hDPSCs 时 MAPK 信号通路的蛋白活化水平44-45
• 2.4 统计学分析45
• 3. 结果45-46
• 4. 讨论46-48
• 小结48-50
• 参考文献50-60
• 附录60-67
• 个人简历和研究成果67-68
• 致谢68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 戴秀峰;吴平;何惠娟;杨展;王旭光;陈坤;;内毒素脂多糖促进人牙髓成纤维细胞凋亡及其对caspase-3活性的影响[J];口腔医学;2008年07期

2 张红梅;王永刚;张晓梅;谭家莉;荀文兴;杨海珍;李蓉;庞楠;曾光;金岩;;脱矿牙本质基质对人牙髓干细胞体外增殖、牙向分化能力的影响[J];口腔医学;2012年03期

3 张彦聪;张志芹;;内毒素脂多糖诱导人牙髓细胞凋亡的机制[J];山东大学学报(医学版);2009年11期

4 王凤明,胡涛,周学东;脂多糖对人牙髓细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响[J];上海口腔医学;2005年01期

5 吴军正,司徒镇强,陈建元,王为,刘斌;体外培养的人牙龈牙周膜牙髓纤维细胞生长及形态特点[J];实用口腔医学杂志;1993年04期

6 宋涛;何娟文;王锦;唐敏;罗进勇;;阻断ERK1/2激酶可增强骨形态发生蛋白9诱导的间充质干细胞成骨分化[J];生物化学与生物物理进展;2012年12期

7 廖清船;肖洲生;秦艳芳;刘亭;赵彦;周宏灏;;植物雌激素金雀异黄酮通过p38MAPK通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[J];中国药理学通报;2006年06期

8 张郁,荫俊,史俊南,肖明振,陈建元,吴军正;人牙髓成纤维细胞等的体外培养、生长特性和鉴定[J];牙体牙髓牙周病学杂志;1991年02期

9 贺慧霞,金岩,史俊南,刘源,胡世颉,董蕊,雷娟;bFGF、TGF-β对人牙髓干细胞增殖和分化能力的影响[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2004年07期

10 蒋宏伟,凌均h

本文编号：355888