WNT7B介导的Wnt经典通路在口腔癌发生发展中的机制研究

发布时间：2022-07-22 15:21

　　口腔癌和头颈部肿瘤是全球第六大常见癌症,口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinomas,OSCC）是其主要类型,其5年生存率仍较低。口腔的特殊开放环境下,口腔黏膜癌发生受到由内源性和外界环境因素共同调控。阐明调节口腔癌发生和发展的分子机制有助于更好地对疾病的病因进行分析,为疾病的诊断和治疗设计更有效的方案;也有助于为药物研发提供新的作用靶标。我们前期研究发现,Wnt信号通路可能与OSCC的发生发展有关。WNT通路广泛参与机体发育以及包括肿瘤在内的疾病发生发展过程,通常可分为Wnt/β-catenin或称为经典Wnt信号通路,平面细胞极性（Wnt-PCP）通路和Wnt-钙信号传导途径。本研究重点关注在OSCC发生中,两个重要的配体蛋白,WNT7B和WNT5A,是否通过Wnt/β-catenin通路,参与口腔癌的发生发展过程。通过对现有病人组织以及GEO数据库中下载的口腔癌病人测序数据进行分析,我们发现人类的19种WNT配体中,WNT7B和WNT5A在口腔癌中都有着不同程度的高表达。针对临床病人和OSCC肿瘤细胞的验证表明,WNT7BmRNA和蛋白在病人及肿瘤细... 

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 口腔癌简介
    1.2 WNT/Β-CATENIN信号通路
    1.3 WNT经典信号通路在口腔癌中的研究进展
    1.4 WNT5A和 WNT7B
    1.5 展望
第二章 材料与方法
    2.1 细胞培养基本方法
        2.1.1 仪器设备和试剂
            2.1.1.1 仪器设备
            2.1.1.2 试剂及材料
        2.1.2 溶液配制
        2.1.3 实验方法
    2.2 组织和细胞总RNA提取及反转录
        2.2.1 仪器设备和试剂
            2.2.1.1 仪器设备
            2.2.1.2 试剂及材料
        2.2.2 溶液配制及准备工作
        2.2.3 实验方法
            2.2.3.1 组织和细胞总RNA的提取
            2.2.3.2 反转录
    2.3 实时荧光定量PCR
        2.3.1 仪器设备和试剂
            2.3.1.1 仪器设备
            2.3.1.2 试剂及材料
        2.3.2 实验方法
    2.4 细胞和组织蛋白提取及WESTERN BLOT
        2.4.1 仪器设备和试剂
            2.4.1.1 仪器设备
            2.4.1.2 试剂及材料
        2.4.2 溶液配制
        2.4.3 实验方法
            2.4.3.1 蛋白提取
            2.4.3.2 蛋白含量测定
            2.4.3.3 蛋白变性
            2.4.3.4 WESTERN BLOT
    2.5 免疫组织化学实验
        2.5.1 仪器设备和试剂
            2.5.1.1 仪器设备
            2.5.1.2 试剂及材料
        2.5.2 溶液配制
        2.5.3 实验方法
    2.6 WNT7B SIRNA转染
        2.6.1 仪器设备和试剂
            2.6.1.1 仪器设备
            2.6.1.2 试剂及材料
        2.6.2 试剂配制
        2.6.3 实验方法
    2.7 WNT7B稳定低表达细胞系的构建
        2.7.1 仪器设备和试剂
            2.7.1.1 仪器设备
            2.7.1.2 试剂及材料
        2.7.2 溶液配制
        2.7.3 实验方法
            2.7.3.1 病毒包装
            2.7.3.2 病毒液转染
            2.7.3.3 嘌呤霉素筛选
    2.8 CCK8 细胞增殖实验
        2.8.1 仪器设备和试剂
            2.8.1.1 仪器设备
            2.8.1.2 试剂及材料
        2.8.2 溶液配制
            2.8.3.1 细胞铺板
            2.8.3.2 检测方法
    2.9 划痕实验
        2.9.1 仪器设备和试剂
            2.9.1.1 仪器设备
            2.9.1.2 试剂及材料
        2.9.2 实验方法
            2.9.2.1 划板法
            2.9.2.2 插件法
    2.10 细胞周期流式检测
        2.10.1 仪器设备和试剂
            2.10.1.1 仪器设备
            2.10.1.2 试剂及材料
        2.10.2 试剂配制
        2.10.3 实验方法
    2.11 动物模型构建
        2.11.1 仪器设备和试剂
            2.11.1.1 仪器设备
            2.11.1.2 试剂及材料
            2.11.1.3 实验动物
        2.11.2 溶液配制
        2.11.3 实验方法
            2.11.3.1成瘤实验
            2.11.3.2 肿瘤样本处理
    2.12 质粒构建
        2.12.1 仪器设备和试剂
            2.12.1.1 仪器设备
            2.12.1.2 试剂及材料
        2.12.2 试剂配制
        2.12.3 实验方法
            2.12.3.1 线性化载体制备
            2.12.3.2 插入片段获得
            2.12.3.3 重组克隆
            2.12.3.4 转化
            2.12.3.5 菌种冻存
            2.12.3.6 质粒提取
    2.13 本章小结
第三章 WNT5A和WNT7B在口腔癌中特异性高表达
    3.1 前期研究基础
    3.2 实验结果
        3.2.1 人口腔癌组织与癌旁组织WNT配体的测序结果
        3.2.2 口腔癌与癌旁组织WNT5A和WNT7B的 QPCR验证
        3.2.3 口腔癌与癌旁组织WNT5A和WNT7B的 IHC验证
    3.3 本章小结
第四章 WNT7B敲减细胞株及WNT5A过表达细胞株构建
    4.1 绪论
    4.2 实验结果
        4.2.1 WNT7B SIRNA瞬时沉默对口腔癌细胞表型的影响
            4.2.1.1 WNT7B SIRNA瞬时沉默成功验证
            4.2.1.2 CCK8 增殖检测结果
            4.2.1.3 划痕实验结果
        4.2.2 WNT7B稳定敲减细胞株构建
            4.2.2.1 慢病毒包装
            4.2.2.2 病毒转染
            4.2.2.3 嘌呤霉素筛选
            4.2.2.4 细胞系验证
        4.2.3 目的基因敲除及过表达细胞系未能成功构建
    4.3 本章小结
第五章 WNT7B稳定敲减在口腔癌细胞中的功能验证
    5.1 绪论
    5.2 CCK8 增殖检测结果
    5.3 划痕实验结果
    5.4 EMT相关蛋白检测结果
    5.5 细胞周期检测结果
    5.6 动物成瘤实验结果
    5.7 本章小结
第六章 Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的变化
    6.1 绪论
    6.2 WNT/Β-CATENIN信号通路下游靶基因的蛋白表达
    6.3 本章小结
第七章 全文总结与展望
    7.1 全文总结
    7.2 后续工作展望
致谢
参考文献



本文编号：3664856