碱性成纤维细胞因子对牙髓干细胞矿化能力影响及机制研究

发布时间：2017-05-30 16:11

  本文关键词：碱性成纤维细胞因子对牙髓干细胞矿化能力影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人口腔内成体干细胞包括牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)、牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）、根尖牙乳头干细胞（Stem cells from the apical papilla，SCAP）等。牙髓干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能，可增殖分化为各种不同种类的功能细胞。目前，在牙髓再生领域，hDPSCs是人们研究的热点，它不仅在体外可以分化为成牙本质细胞样细胞，还可以分化为脂肪细胞，血管内皮细胞，神经细胞等，而且还可以在体内形成牙髓样的疏松结缔组织。因此，hDPSCs的体外培养可以作为研究牙髓生物学的体外模型，在牙髓再生的组织工程学应用中具有广阔前景。 目前，虽然许多的体内研究已经证实bFGF能够促进骨的再生［1-3］。但是，关于bFGF对细胞矿化能力影响的体外研究中却存在着许多争议。另外，在bFGF对hDPSCs刺激的体外研究中同样也存在类似的争议，有的研究表明bFGF能促进hDPSCs产生碱性磷酸酶［4］，也有实验表明bFGF会抑制hDPSCs的矿化能力［5］。众所周知，反应性牙本质和第三期牙本质的形成是牙齿损伤修复的重要机制，而在其形成过程中，hDPSCs的矿化能力起着决定性的作用。所以弄清楚bFGF对hDPSCs的矿化能力的影响及其作用机制，对牙齿损伤修复的研究有着重要的科研和临床意义。 本实验以hDPSCs作为种子细胞，，在体外条件下，通过细化bFGF对hDPSCs的刺激条件，来观察bFGF对hDPSCs矿化能力的影响，从而进一步明确bFGF对hDPSCs矿化能力的调节作用。同时，我们选择MAPK通路，来研究MAPK通路在bFGF对hDPSCs作用中的信号调节机制，这将为进一步研究hDPSCs的成牙本质细胞分化机制，以及在牙齿再生研究中hDPSCs的组织工程应用等提供实验依据，同时为将来hDPSCs的临床应用提供新的思路和途径。 实验结果如下： 1. hDPSCs的分离、培养及鉴定 通过经典的酶消化法分离出原代hDPSCs，用有限稀释技术挑选出单克隆，并进行扩大培养。采用流式细胞术和免疫细胞化学技术对hDPSCs的表面标记物进行了鉴定，证实所培养细胞为hDPSCs。同时，进行了多向分化能力的鉴定，通过体外诱导，使hDPSCs分化为成牙本质细胞样细胞和脂肪细胞，证实了所培养细胞具有多向分化潜能。 2. bFGF对hDPSCs体外矿化能力的影响 通过设定不同的培养条件，来观察bFGF对hDPSCs体外矿化能力的影响，以茜素红定量的方法来检查不同组别的矿化能力。实验显示，bFGF在hDPSCs的矿化阶段可以抑制其矿化能力，而在细胞增殖阶段，用bFGF刺激hDPSCs，随着培养时间的不同也会有不同的结果。bFGF刺激一周，hDPSCs的矿化能力增强，刺激两周，其矿化能力减弱。同时，bFGF刺激后hDPSCs矿化能力的改变，可以随着传代而延续。 3.MAPKs信号通路在bFGF刺激hDPSCs作用的初步探讨 bFGF刺激hDPSCs后，可以迅速的激活ERK，P38和JNK通路，三个蛋白的磷酸化水平均明显升高，而且对ERK的激活尤为迅速。在用抑制剂抑制ERK，P38和JNK通路后，bFGF的刺激并不能使P38和JNK的磷酸化水平升高，而ERK的磷酸化水平却仍然升高，但比不用抑制剂时要低。而对于干细胞基因Nanog，OCT4、SOX2的影响方面，bFGF刺激hDPSCs后，三种干细胞基因的表达水平都明显升高。当P38和JNK通路被抑制后再用bFGF刺激hDPSCs，三种干细胞基因的表达比阳性对照组都相应下调，但是当ERK被抑制后再用bFGF刺激hDPSCs，虽然Nanog，OCT4的表达下调，但SOX2的表达却明显上调。这两个实验说明，除了MAPK通路外，还有其他通路参与了bFGF刺激后hDPSCs的细胞生物学变化的调控。 综上所述，bFGF对hDPSCs的成骨分化有很重要的影响，在细胞的不同阶段给以bFGF的刺激对成骨分化可以产生不同的影响。bFGF可以激活hDPSCs的MAPK通路，但是MAPK通路不是调节hDPSCs生物学改变的唯一通路，还有其他旁路参与其中。本实验结果为进一步研究hDPSCs的分化机制提供了实验基础，同时为牙齿再生的组织工程研究提供了新的思路和途径。
【关键词】：牙髓干细胞 碱性成纤维细胞生长因子 矿化 MAPK
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R780.2
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-27
• 第一部分 人牙髓干细胞的分离培养和鉴定27-38
• 实验一 人牙髓干细胞的分离和培养27
• 1 材料与方法27-32
• 2 实验结果29-30
• 3 讨论30-32
• 实验二 hDPSCs的鉴定32-38
• 1 材料与方法32-34
• 2 实验结果34-36
• 3 讨论36-38
• 第二部分 碱性成纤维细胞生长因子对牙髓干细胞成骨分化作用的体外研究38-50
• 实验一 不同培养条件下bFGF对hDPSCs体外矿化能力的影响38-47
• 1 材料和方法39-40
• 2 实验结果40-45
• 3 讨论45-47
• 实验二 不同培养条件下bFGF对hDPSCsALP活性的影响47-50
• 1 材料和方法47-48
• 2 实验结果48-49
• 3 讨论49-50
• 第三部分 碱性成纤维细胞生长因子对牙髓干细胞作用机制的初步研究50-66
• 实验一 bFGF对hDPSCs作用中MAPKs信号通路的研究50-57
• 1 材料与方法51-52
• 2 实验结果52-55
• 3 讨论55-57
• 实验二 MAPKs通路在bFGF对hDPSCs分化影响中的作用57-66
• 1 材料与方法57-59
• 2 实验结果59-63
• 3 讨论63-66
• 全文总结66-68
• 参考文献68-76
• 个人简历和研究成果76-77
• 致谢77

【参考文献】

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  本文关键词：碱性成纤维细胞因子对牙髓干细胞矿化能力影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：407484