ClC-3氯通道介导甲状旁腺激素对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用研究

发布时间：2017-06-24 02:10

  本文关键词：ClC-3氯通道介导甲状旁腺激素对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景:骨代谢紊乱包括骨形成和骨吸收过程的不调,骨吸收障碍可导致骨质硬化症,而骨形成不足会引起骨质疏松症。骨质疏松症患者的骨密度降低、骨量减少、骨小梁排列紊乱的特点也给其缺牙种植修复、错牙合畸形正畸矫治等口腔临床治疗带来了诸多问题,严重影响着患者的健康和生活质量。甲状旁腺素(PTH)是体内调节骨代谢的重要激素之一,已有研究表明持续性给予PTH刺激可造成骨量丢失及骨密度降低,而间断性给予PTH刺激可使骨密度及骨强度显著增高,其具体机制复杂而不明确。Cl C-3氯通道是一类电压门控型的离子通道,然而Cl C-3基因敲除小鼠表现出生长阻滞及骨发育的异常,着提示我们Cl C-3氯通道可能与骨发育和骨代谢有关。我们课题组前期研究发现,Cl C-3氯通道存在于成骨细胞中,具有增强细胞体外矿化能力及促进成骨分化的作用。既然PTH和Cl C-3氯通道在骨代谢过程中都具有促进骨形成的作用,那么研究二者在成骨分化过程中是否具有某种内在的联系就具有重要的意义。研究目的:本研究旨在通过观察在不同浓度及不同给药方式的PTH刺激下,MC3T3-E1细胞中Cl C-3氯通道及成骨相关基因的表达变化,并通过干扰Cl C-3氯通道的表达来初步探索成骨细胞中Cl C-3氯通道在PTH的促进成骨分化过程中的作用,为PTH在促进成骨作用的机制研究提供新的思路。研究内容:(1)研究不同浓度及不同给药方式的PTH刺激对MC3T3-E1细胞增殖能力及其成骨相关基因表达的影响。(2)研究PTH刺激对MC3T3-E1细胞中Cl C-3氯通道表达的影响。(3)初步探究Cl C-3氯通道在PTH促成骨分化中的作用。研究方法:(1)通过CCK-8试剂盒法检测不同实验分组的MC3T3-E1细胞的增殖情况,同时利用Real-Time PCR法检测MC3T3-E1细胞中成骨相关基因Alp、Runx2的表达情况。(2)通过Real-Time PCR方法及细胞免疫荧光法检测PTH刺激对Cl C-3氯通道表达的影响,初步分析两者之间的关系。(3)利用免疫荧光方法检测不同Cl C-3氯通道表达水平的MC3T3-E1细胞在PTH刺激下Cl C-3氯通道蛋白的变化情况,利用Real-Time PCR检测各组细胞中成骨相关基因及Clcn3的表达情况,并进一步观察各组细胞体外矿化能力的变化。研究结果:(1)10-9 M的PTH间断刺激下,MC3T3-E1细胞中Alp、Runx2的表达最显著。(2)10-9 M的PTH间断刺激时,MC3T3-E1细胞中的C l C-3氯通道表达量在各实验组中最强。(3)10-9 M的PTH刺激MC3T3-E1细胞,C l C-3 si RNA干扰组比C l C-3氯通道正常表达组的成骨相关基因表达量明显降低,同时,体外矿化能力也减弱。结论:(1)合适浓度的PTH间断刺激有促进成骨细胞成骨分化作用。(2)MC3T3-E1细胞中的Cl C-3氯通道能够响应PTH的刺激发生变化。(3)Cl C-3氯通道介导了PTH对成骨细胞的促成骨分化作用。
【关键词】：甲状旁腺激素 ClC-3氯通道 骨代谢 成骨分化 基因转染
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781
【目录】：

• 缩略语表6-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-14
• 文献回顾14-24
• 第一部分 PTH刺激对MC3T3-E1细胞增殖能力及成骨相关基因表达的影响24-33
• 1 材料24-25
• 1.1 实验材料24
• 1.2 实验仪器24
• 1.3 细胞系24-25
• 2 方法25-27
• 2.1 细胞培养25
• 2.2 PTH处理细胞25
• 2.3 细胞形态学的分析25
• 2.4 细胞增殖能力检测25-26
• 2.5 细胞总RNA提取及反转录26
• 2.6 Ream- Time PCR26-27
• 2.7 统计学方法27
• 3 结果27-31
• 3.1 不同浓度PTH刺激对MC3T3-E1细胞形态的影响27-28
• 3.2 不同浓度PTH刺激对MC3T3-E1细胞增殖的影响28-29
• 3.3 不同浓度PTH刺激对MC3T3-E1细胞成骨相关基因（Alp、Runx2）表达影响29-31
• 4 讨论31-33
• 第二部分 PTH刺激对MC3T3-E1细胞中ClC-3 氯通道表达的影响33-40
• 1 材料33-34
• 1.1 实验材料33
• 1.2 实验仪器33-34
• 1.3 细胞系34
• 2 方法34-35
• 2.1 细胞培养34
• 2.2 PTH处理细胞34
• 2.3 细胞总RNA提取及反转录34
• 2.4 Ream- Time PCR34-35
• 2.5 细胞免疫荧光实验35
• 2.6 统计学方法35
• 3 结果35-38
• 3.1 不同浓度PTH对MC3T3-E1细胞中Clcn3基因表达的影响35-36
• 3.2 PTH对MC3T3-E1细胞中C lC-3 氯通道蛋白表达的影响36-38
• 4 讨论38-40
• 第三部分 ClC-3 氯通道在PTH刺激促进MC3T3-E1细胞成骨分化中的作用40-50
• 1 材料40-41
• 1.1 实验材料40
• 1.2 实验仪器40-41
• 1.3 细胞系41
• 2 方法41-43
• 2.1 细胞培养41
• 2.2 细胞处理41-42
• 2.3 免疫荧光检测MC3T3-E1细胞中C lC-3 蛋白的表达42
• 2.4 Real- Time PCR检测MC3T3-E1细胞中成骨相关基因的表达42-43
• 2.5 细胞体外矿化能力检测43
• 2.6 统计学方法43
• 3 结果43-48
• 3.1 各组MC3T3-E1细胞中C lC-3 氯通道蛋白的表达水平43-45
• 3.2 不同ClC-3 氯通道表达水平对PTH刺激下MC3T3-E1细胞成骨相关基因表达的影响45-46
• 3.3 ClC-3 氯通道介导的PTH刺激促进MC3T3-E1细胞成骨分化的作用46-48
• 4 讨论48-50
• 小结50-51
• 参考文献51-60
• 个人简历和研究成果60-61
• 致谢61-62

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