ClC-7引起牙缺失的动物实验研究

发布时间：2017-06-25 11:13

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【摘要】：在罕见的遗传性骨病-骨硬化症病例中,CLCN7基因发生了突变,患者表现为全身弥漫性骨密度增高,其核心机制是当ClC-7功能障碍时破骨细胞不能正常发挥作用。课题组前期研究发现CLC-7蛋白表达于小鼠胚胎及出生后1天的小鼠牙胚中,并且一些骨硬化症患者口腔表现为牙齿缺失,未萌出,牙根发育停止,且有牙釉质发育不全表现,Clcn7基因敲除小鼠也表现为牙不萌出。ClC-7功能障碍出现的这些牙异常是由于破骨细胞异常直接造成的还是由于ClC-7直接参与了牙胚发育的调控尚不清楚,本研究拟采用肾被膜移植牙胚的方法,模拟一个缺乏破骨细胞的环境使牙胚在此环境中的生长,通过Clcn7 shRNA慢病毒感染、降低牙胚Clcn7基因的表达,从而观察牙胚生长的情况。方法:1.Clcn7 shRNA慢病毒的制备及牙胚感染慢病毒体系的建立。取E13.5天Balb/c小鼠的下颌第一磨牙牙胚,用带GFP绿色荧光的shRNA慢病毒将其感染,连续4天观察感染后牙胚荧光表达情况,以确定最佳的感染复数(MOI)。在确定了最佳感染复数后,用针对Clcn7 shRNA慢病毒感染牙胚后,提取牙胚组织RNA,进行实时定量PCR实验,验证对Clcn7的基因沉默效果。2.Clcn7基因沉默对牙形态的影响。将感染Clcn7 shRNA慢病毒的牙胚移植于同种雄性成年小鼠的肾被膜下,4周后处死宿主小鼠,取出移植块,进行micro-CT扫描,观察牙齿形态结构的变化。将牙胚移植块进行石蜡切片、he染色及azon染色,观察牙齿各个结构如牙根、牙本质、牙周组织等的改变,观察clcn7对牙齿发育的影响。3.clcn7基因沉默对牙相关蛋白表达的影响。采用免疫组化方法进一步研究clc-7及dsp的表达,初步判断clc-7对牙发育影响的可能机制。另外选取成牙本质细胞mdpc-23细胞系作为研究对象,进行clcn7sirna转染,提取细胞mrna,利用实时定量pcr实验观察clcn7及dspp的表达情况。结果:1.clcn7shrna慢病毒对牙胚的感染复数(moi)为5000tu/每个牙胚,感染时间为24小时。在这种条件下,感染效果最好,绿色荧光表达最强。2.牙胚感染clcn7shrna慢病毒后,用牙胚组织提取rna反转录得到的cdna做实时定量pcr结果显示,实验组比阴性对照组clcn7的表达降低了70%(p0.05)。3.clcn7shrna慢病毒感染牙胚后,将牙胚移植于肾被膜下4周后micro-ct扫描结果显示,空白对照组及阴性对照组牙齿发育完好,结构完整,牙根发育正常,牙尖轮廓清晰,实验组牙齿畸形,牙根弯曲或变短,牙尖结构不明显。4.牙齿石蜡切片he染色及azon染色结果显示,空白对照组及阴性对照组牙齿结构完整,前期牙本质结构正常,牙周组织结构正常,其牙周韧带、牙骨质及牙槽骨结构正常、清晰。而实验组部分前期牙本质变宽,牙根弯曲,牙周组织中正常的牙周韧带、牙骨质及牙槽骨消失,充满了排列紊乱的成纤维细胞。5.石蜡切片免疫组织化学染色结果显示,clc-7及dsp表达于成牙本质细胞及前期牙本质,与空白对照组及阴性对照组相比,实验组clc-7的表达未见明显降低,而dsp表达明显降低。6.成牙本质细胞mdpc-23细胞系实时定量pcr结果显示:与阴性对照组相比,clcn7sirna实验组clcn7的表达明显降低,而dspp的表达未发生改变。结论:1.无论是在牙胚组织还是成牙本质细胞mdpc-23细胞系中,clcn7shrna慢病毒或sirna可有效地沉默clcn7基因,降低clc-7的表达。2.采用肾被膜下移植牙胚的方法,模拟一个缺乏破骨细胞的环境,使牙胚在此环境中生长,从而观察ClC-7在牙齿发育中所起的作用,同时也验证了肾被膜下微环境对牙齿发育的可行性,为牙胚的生长及发育提供了极好的环境。3.CLC-7表达于前期牙本质及成牙本质细胞。4.ClC-7在牙胚的发育中具有重要的作用,可影响牙齿的形态,牙根的发育,牙本质的发育。ClC-7可能是通过影响DSP的表达进而影响牙本质的发育,最终影响牙齿的发育。
【关键词】：RNA干扰 shRNA ClC-7 牙胚 慢病毒 MDPC-23
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R780.2
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-12
• 文献回顾12-25
• 实验一 Clcn7 sh RNA慢病毒的制备及慢病毒感染牙胚实验体系的建立25-33
• 1 材料与设备25-26
• 2 实验方法26-30
• 3 结果30-32
• 4 讨论32-33
• 实验二 Clcn7基因沉默对牙形态的影响33-43
• 1 材料与设备33-36
• 2 实验方法36-39
• 3 结果39-42
• 4 讨论42-43
• 实验三 Clcn7基因沉默对牙相关蛋白表达的影响43-52
• 1 材料与设备43-44
• 2 实验方法44-47
• 3 结果47-50
• 4 讨论50-52
• 小结52-54
• 参考文献54-67
• 个人简历和研究成果67-68
• 致谢68

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