TLR4对脂多糖诱导的大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响

发布时间：2017-07-04 12:11

  本文关键词：TLR4对脂多糖诱导的大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响

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【摘要】：第一部分大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞的分离培养目的：分离大鼠颞下颌关节滑膜组织,培养滑膜成纤维细胞,并建立稳定的滑膜成纤维细胞体外培养体系。方法：取大鼠颞下颌关节双板区的滑膜组织,采用酶消化法分离培养原代滑膜细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,并采用免疫荧光细胞化学方法检测波形蛋白(vimentin)和CD68的表达。结果：倒置显微镜下可见细胞呈梭形,细胞外形均匀一致,具有成纤维细胞的形态,所有培养的滑膜细胞均对CD68蛋白表达阴性,波形蛋白表达阳性。结论：采用酶消化法可成功分离培养大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞,为后续实验研究奠定了基础。第一部分大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞的分离培养目的：分离大鼠颞下颌关节滑膜组织,培养滑膜成纤维细胞,并建立稳定的滑膜成纤维细胞体外培养体系。方法：取大鼠颞下颌关节双板区的滑膜组织,采用酶消化法分离培养原代滑膜细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,并采用免疫荧光细胞化学方法检测波形蛋白(vimentin)和CD68的表达。结果：倒置显微镜下可见细胞呈梭形,细胞外形均匀一致,具有成纤维细胞的形态,所有培养的滑膜细胞均对CD68蛋白表达阴性,波形蛋白表达阳性。结论：采用酶消化法可成功分离培养大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞,为后续实验研究奠定了基础。第二部分TLR4对脂多糖诱导的滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响目的：研究Toll样受体-4(Toll like receptors 4,TLR4)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞分泌IL-1p、TNF-α的影响,探讨TLR4在颞下颌关节紊乱病发病机制中的作用。方法：以终浓度为0,0.1,1,10,100 ng/mL的LPS刺激滑膜成纤维细胞12h,或以LPS(终浓度100ng/mL)刺激细胞0,1,6,12,24h,检测LPS刺激与IL-1β、TNF-α表达的量效和时效性关系,选择最佳的刺激浓度与时间。应用LPS刺激细胞,Western blot方法检测细胞内TLR4、MyD88的表达变化,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α的表达情况,应用Real-time PCR检测细胞内TLR4、 MyD88、IL-1β、TNF-α mRNA的表达变化。用TLR4的特异性抑制剂TAK-242预处理滑膜成纤维细胞后,再加入LPS刺激细胞,应用Real-time PCR检测IL-1β、TNF-αmRNA的表达变化,采用ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α的表达情况。结果：经LPS刺激后,随着LPS刺激浓度的增加IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白表达量逐渐升高。并且,二者与LPS刺激持续时间呈现一定的时间依赖关系,IL-1β、TNF-α蛋白表达量在12h到达高峰,IL-1β、TNF-αmRNA在6h到达高峰。LPS能够明显增强TLR4、MyD88 mRNA及蛋白表达,TAK-242的应用能显著抑制LPS诱导的滑膜成纤维细胞IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白的表达。结论：TLR4在LPS诱导的滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、TNF-α过程中起到重要的调控作用,特异性抑制剂TAK-242可以有效地抑制LPS诱导的IL-1β、 TNF-αmRNA及蛋白的表达。TLR4可能参与了颞下颌关节紊乱病的发生发展过程。
【关键词】：滑膜成纤维细胞 酶消化法 原代培养 IL-1β TNF-α TLR4 滑膜成纤维细胞 TAK-242
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R782.6
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 缩略词表10-11
• 前言11-13
• 第一部分 大鼠颞下颌关节滑膜成纤维细胞的分离培养13-20
• 1 材料与方法13-17
• 1.1 实验动物来源13
• 1.2 主要仪器和试剂13-14
• 1.3 实验方法14-17
• 2 实验结果17-18
• 2.1 滑膜细胞的形态学观察17-18
• 2.2 免疫荧光细胞化学鉴定滑膜成纤维细胞18
• 2.3 采用MTT法检测滑膜成纤维细胞的增殖情况18
• 3 讨论18-20
• 4 结论20
• 第二部分 TLR4对脂多糖诱导的滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响20-36
• 1 材料与方法20-27
• 1.1 细胞来源20
• 1.2 主要仪器和试剂20-21
• 1.3 实验方法21-27
• 2 实验结果27-31
• 2.1 LPS对SFs表达IL-1β、TNF-α的影响27-29
• 2.2 LPS对SFs表达TLR4、MyD88的影响29-30
• 2.3 TLR4对LPS诱导的滑膜成纤维细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响30-31
• 3 讨论31-35
• 4 结论35-36
• 参考文献36-41
• 致谢41-42
• 攻读学位期间发表的学术论文目录42-43
• 附件43

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本文编号：517708