构建含有间充质干细胞和外泌体的脱细胞组织水凝胶用于修复大体积肌肉缺损的实验研究

发布时间：2017-07-07 17:00

  本文关键词：构建含有间充质干细胞和外泌体的脱细胞组织水凝胶用于修复大体积肌肉缺损的实验研究

  更多相关文章： 骨骼肌缺损 组织工程 脱细胞组织 间充质干细胞 促血管化 外泌体

【摘要】：由于遗传疾病、发育异常、肿瘤手术切除或外伤所导致的大体积颅颌面骨骼肌缺损一直以来影响着患者口颌功能的完整和面部外形的美观,现在临床常用的修复方法包括采用各种无生物活性材料制作的赝复体及游离或带缔肌皮瓣的移植,但这些治疗手段均具有一些局限性,如无法恢复肌肉伸缩功能、移植手术对于缺损部位的特定要求或供体部位组织的损伤等,因此高效的、无损的获得缺损肌肉组织功能与外形的完整修复成为了该领域所有医者追逐的目标。近年来随着生命科学与其他相关学科的快速发展与融合,组织工程技术作为一门交叉学科越来越受到人们的重视,在肌肉缺损修复领域也得到了广泛的关注。组织工程修复肌肉缺损就是利用生物相容性良好的支架材料将具有形成肌纤维潜力的细胞导入肌肉缺损处,这些细胞通过自体分化或分泌诱导因子使得肌肉纤维在缺损区域再生并行使功能,从而达到修复肌肉组织的目的。迄今为止已经有多种基于不同支架材料和祖细胞或干细胞的研究方法应用于该领域,然而由于诱导微环境的缺乏或移植区域血供营养不足等原因,大体积肌肉缺损仍无法得到有效地修复。因此,为了解决这些问题,我们基于已有的研究成果,构建出一种由组织特异性的脱细胞水凝胶和具有肌向分化潜能的间充干细胞构成的修复体,并复合了具有促血管生成能力的外泌体,用于修复大体积肌肉缺损。首先,我们分离、培养和鉴定了大鼠脐带间充质干细胞(r UCMSCs),并制作了脱细胞猪骨骼肌组织水凝胶(p DMH),通过细胞计数和活/死细胞染色观察r UCMSCs在该生物水凝胶内的生长、增殖情况,筛选p DMH的最佳使用浓度。然后通过基因蛋白检测以及细胞形态学观察p DMH对于r UCMSCs成肌分化的促进作用。其次,我们培养并鉴定了大鼠脐静脉内皮细胞(r UVECs),然后通过划痕实验、Transwell透膜实验、染色、成管腔实验以及成血管相关基因蛋白检测对比了r UCMSC在常氧或低氧培养条件下所分泌的物质对r UVECs增殖、迁移以及成血管的能力的影响。在此基础上,我们提取了低氧条件培养下的r UCMSCs产生的外泌体(exosome),并研究了不同浓度该外泌体对于r UVECs增殖,迁移及成血管能力的影响,确定了exosome的最佳使用浓度。随后在大鼠皮下移植了含有一定浓度exosomes的MatrigelTM基质胶,观察其短期促进血管生成的能力。最后,我们构建了含有r UCMSCs和低氧条件下r UCMSCs分泌的exosomes的脱细胞骨骼肌水凝胶用于修复大鼠胫骨前肌大体积缺损,并对其短期及长期的修复效果进行了组织学及功能学检测。实验结果证明,脱细胞猪心肌组织水凝胶所构成的三维培养系统可以有效支持r UCMSCs的生长、增殖,并且对细胞肌向分化具有显著的促进作用。此外,处于低氧条件中的r UCMSCs所分泌的exosomes在一定浓度下能够明显提高r UVECs的增殖,迁移及体外成血管能力,并在体内促进了新生血管的生成。而含有这种exosomes和r UCMSC的脱细胞组织水凝胶修复体在修复大鼠胫骨前肌大体积缺损时取得了令人满意的效果,为口腔颌面部肌肉大体积缺损的修复提供了一种新的策略。
【关键词】：骨骼肌缺损 组织工程 脱细胞组织 间充质干细胞 促血管化 外泌体
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R782.2
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-16
• 文献回顾16-35
• 第一部分 脱细胞组织生物水凝胶的构建及其对脐带间充质干细胞生长、增殖和肌向分化的影响35-55
• 1 材料35-38
• 1.1 主要试剂与仪器35-37
• 1.2 材料37
• 1.3 实验动物37-38
• 2 方法38-46
• 2.1 猪来源脱细胞骨骼肌水凝胶（p DMH）的制备38-40
• 2.2 大鼠脐带间充质干细胞（r UCMSCs）分离培养及鉴定40-41
• 2.3 不同浓度脱细胞骨骼肌水凝胶对于r UCMSCs生长、增殖的影响41-42
• 2.4 脱细胞骨骼肌水凝胶对于r UCMSCs肌向分化的促进作用42-46
• 2.5 统计学分析46
• 3 结果46-53
• 3.1 脱细胞骨骼肌的制备46-48
• 3.2 脱细胞骨骼肌水凝胶的制备与检测48
• 3.3 大鼠脐带间充质干细胞的培养与鉴定48-50
• 3.4 脱细胞骨骼肌水凝胶对于脐带间充质干细胞生长与增殖的影响50-51
• 3.5 脱细胞骨骼肌水凝胶对于脐带间充质干细胞成肌能力的影响51-53
• 4 讨论53-54
• 5 小结54-55
• 第二部分 脐带间充质干细胞来源的外泌体在体内、体外对血管生成的促进作用55-76
• 1 材料55-57
• 1.1 主要试剂和仪器55-57
• 1.2 材料57
• 1.3 实验动物57
• 2 方法57-65
• 2.1 大鼠脐静脉内皮细胞（r UVECs）的分离培养与鉴定57-58
• 2.2 大鼠脐带间充质干细胞对大鼠脐静脉内皮细胞的影响58-61
• 2.3 大鼠脐带间充质干细胞来源外泌体（r UCMSCs-Exosome）对大鼠脐静脉内皮细胞的影响61-63
• 2.4 rUCMSCs-Exosome对于体内成血管的影响63-65
• 2.5 统计学分析65
• 3 结果65-73
• 3.1 大鼠脐静脉内皮细胞的培养与鉴定65-66
• 3.2 大鼠脐带间充质干细胞条件培养液对于大鼠脐静脉内皮细胞生物学特性的影响66-69
• 3.3 来源于低氧条件下大鼠脐带间充质干细胞的外泌体对于脐静脉内皮细胞生物学特性的影响69-72
• 3.4 来源于细胞低氧条件培养液的外泌体体内促进血管生成的作用72-73
• 4 讨论73-74
• 5 小结74-76
• 第三部分 含有促血管生成外泌体的脱细胞外基质-间充质干细胞生物水凝胶修复大鼠胫骨前肌大体积缺损76-89
• 1 材料76-77
• 1.1 主要试剂与仪器76-77
• 1.2 材料77
• 1.3 动物77
• 2 方法77-80
• 2.1 组织工程生物水凝胶修复体的制备77-78
• 2.2 大鼠胫骨前肌（TA）大体积缺损修复78-79
• 2.3 组织学检测79
• 2.4 功能学检测79-80
• 2.5 统计学分析80
• 3 结果80-86
• 3.1 组织工程生物水凝胶修复的制备80-81
• 3.2 胫骨前肌大体积缺损修复效果81-86
• 4 讨论86-88
• 5 小结88-89
• 结论89-91
• 参考文献91-116
• 附录116-118
• 个人简历和研究成果118-120
• 致谢120

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