应用双向荧光差异凝胶电泳和质谱技术筛选口腔扁平苔藓唾液差异蛋白

发布时间：2017-07-16 18:21

  本文关键词：应用双向荧光差异凝胶电泳和质谱技术筛选口腔扁平苔藓唾液差异蛋白

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【摘要】：目的：口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是一种常见的口腔黏膜疾病，病因不明，易反复发作，有一定的癌变倾向，被世界卫生组织（WHO）定义为癌前状态。在我们前期研究中，应用基因芯片技术筛选出142个差异表达基因，而基因是通过指导蛋白质的合成来进行表达。随着人类基因组测序计划的完成，研究重点逐渐转向功能基因组学，然而仅凭基因DNA序列及其表达仍不足以解决基因表达时间及表达量甚至蛋白质的翻译后加工及修饰等情况，因此，这些基因组学不能解决的问题可以在蛋白质组学的研究中找到答案。目前，随着蛋白质组学技术的发展，其研究越来越多地应用到生命科学、医学等各个领域，尤其是在研究疾病的病因及发病机制中发挥着重要作用。以往采用双向凝胶电泳技术研究扁平苔藓差异蛋白的方法误差较大，蛋白定量不准确，而且蛋白质组学对组织和血液研究较多，对唾液的研究较少。而唾液取材的简便、安全、低成本和无创性以及含有许多有助于疾病早期诊断的蛋白质，使得唾液的蛋白质组学研究发展受到人们的关注，但是由于唾液的蛋白质种类较多，蛋白质浓度相差较大，对于唾液蛋白的提取没有统一标准和规范，还需要进一步探索。本研究采用双向荧光差异凝胶电泳和质谱技术筛选、鉴定与口腔扁平苔藓患者唾液有关的差异蛋白，以探讨唾液中某些相关蛋白质表达量的变化与口腔扁平苔藓发生的可能作用机制。 方法： 1提取唾液蛋白预试验 分别采用甲醇/NH4HCO3沉淀法、苯酚抽提法及2-D Clean-Up Kit的方法提取新鲜唾液蛋白，并将苯酚抽提复溶后的蛋白经超声处理50s，通过观察十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白条带，确定提取唾液蛋白的最适方法。 2唾液蛋白十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 收集9例口腔扁平苔藓患者及9例正常人唾液，为了减少个体差异对__________________________________________________________________________________________________本研究的影响，分别将每组3例唾液混合，作为一个试验样品。按照2-DClean-Up Kit说明书操作提取唾液总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白条带观察唾液蛋白的提取情况。 3双向荧光差异凝胶电泳技术分离蛋白质、质谱技术鉴定差异蛋白 采用双向荧光差异凝胶电泳技术分离蛋白质，Typhoon9410扫描获取电泳图谱，DecyderTM2D6.5软件寻找差异蛋白质点，将凝胶进行Deeppurple染色，然后用Ettan Spot Picker将差异蛋白质点从凝胶中切下，胰酶酶解，应用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对差异蛋白质点进行分析，将生成的质谱数据用Bio Works3.3.1数据分析软件中的SEQUEST算法进行计算，在NCBI中搜索数据库，鉴定蛋白质。 结果： 1预试验结果 预试验应用甲醇/NH4HCO3沉淀法、苯酚抽提法提取唾液蛋白，用DIGEbuffer复溶后均有粘稠透明胶状物出现，且甲醇/NH4HCO3沉淀法提取蛋白后蛋白有明显的丢失现象，将胶状物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后出现蛋白条带，说明唾液蛋白复溶时并没有完全溶解到DIGEbuffer中，为了增加唾液蛋白的溶解度，将苯酚抽提蛋白复溶后经超声处理50s，测定蛋白浓度，尽管蛋白浓度有所上升，但仍有胶状物存在，唾液蛋白并没有完全溶解。而经2-D Clean-Up Kit提取蛋白，DIGE buffer复溶蛋白后，没有发现胶状物的存在，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示各样品条带清晰，无明显蛋白质丢失、降解。2-D Clean-UpKit适合唾液蛋白质的提取。 2十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 口腔扁平苔藓患者组和正常人组用2-D Clean-Up Kit提取唾液蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示蛋白条带清晰，没有明显蛋白丢失和降解。 3双向荧光差异凝胶电泳结果 双向荧光差异凝胶电泳分离蛋白质后，图像重复性较好、分辨率较高，蛋白质等电点和分子量分布范围较广。DecyderTM2D6.5软件分析扁平苔藓患者组和正常人组唾液差异蛋白质点数平均为317±71个，，并用液相色谱-质谱技术鉴定了重复性较好的4个差异蛋白质点，分别为分泌型IgA1、锌α-2-糖蛋白、唾液淀粉酶、血清白蛋白，它们在OLP患者唾液中表达量均上调。 结论： 12-D Clean-Up Kit适合唾液蛋白质的提取。 2口腔扁平苔藓患者唾液中存在差异蛋白表达，其中分泌型IgA1、锌α-2-糖蛋白、唾液淀粉酶、血清白蛋白在口腔扁平苔藓患者中表达上调，提示它们可能参与了口腔扁平苔藓的发生、发展。
【关键词】：口腔扁平苔藓 唾液 蛋白质组学 双向荧光差异凝胶电泳 液相色谱-质谱技术
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R781.5
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11
• 材料与方法11-22
• 结果22-24
• 附图24-28
• 附表28-29
• 讨论29-30
• 结论30-32
• 参考文献32-34
• 综述 唾液蛋白质组学在口腔扁平苔藓研究中的应用34-44
• 参考文献40-44
• 致谢44-45
• 个人简历45

【参考文献】

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1 刘军莲;李勇枝;高建义;盖玉清;王静;薛春美;辛冰牧;;蛋白质组学技术研究进展[J];航天医学与医学工程;2009年02期

2 曹晓梅,陈冰,冷伟卫,李金恒;高效液相色谱法同时测定血浆中异烟肼和乙酰异烟肼[J];医学研究生学报;2005年05期

3 吴晓歌;鲁新宇;;质谱技术在蛋白质组学中的应用发展[J];医学研究生学报;2007年10期

4 蒋红柳;王文梅;段宁;王翔;;羟氯喹治疗口腔扁平苔藓前后的唾液双向电泳研究[J];临床口腔医学杂志;2010年03期

5 张水龙,许国祺,曹宏康,钟文静;口腔扁平苔藓损害组织中幽门螺旋杆菌DNA的原位检测及其意义[J];临床口腔医学杂志;1999年02期

6 马波;赵吉生;宋燕;;利用双向凝胶电泳技术进行胃癌差异蛋白质组研究[J];中国临床医学;2007年02期

7 武影;束蓉;刘宏伟;;慢性牙周炎患者和健康者非刺激性全唾液中的差异蛋白比较[J];华西口腔医学杂志;2011年05期

8 熊伟;;蛋白质组双向电泳技术在生物医学研究中的应用进展[J];生命科学仪器;2010年01期

9 张养军,蔡耘,王京兰,李晓海,钱小红;蛋白质组学研究中的色谱分离技术[J];色谱;2003年01期

10 钟春英,彭蓉,彭建新,洪华珠;蛋白质芯片技术[J];生物技术通报;2004年02期

本文编号：549959