生物钟基因Per2对人口腔鳞癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的调控作用

发布时间：2017-07-19 05:21

  本文关键词：生物钟基因Per2对人口腔鳞癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的调控作用

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【摘要】：第一部分口腔鳞癌细胞株培养和口腔黏膜上皮细胞的原代培养目的:获得纯化的口腔黏膜上皮细胞,并对口腔黏膜上皮细胞是否纯化进行检测。方法:收集重庆医科大学附属口腔医院颌面外科对颌面整形患者手术中切除的口腔正常粘膜,于1.0u/ml dispaseⅡ中4℃消化过夜。显微镜下分离粘膜组织的上皮层,0.25%胰酶消化,用口腔角质细胞培养基OKM接种于鼠尾胶包被六孔板中。置于37℃,95%湿度,5%CO2培养箱。4 d传一代,选取第2代细胞提取m RNA、蛋白,第3代细胞制作细胞爬片。取口腔粘膜上皮细胞细胞爬片进行角蛋白染色,一抗角蛋白抗体4℃过夜。二抗工作液常温孵1 h?显微镜下分别用×40,×100,×200观察,拍照?结果:口腔粘膜上皮细胞呈铺路石样,角蛋白染色结果表明阳性率100%,证实为纯化的上皮细胞.结论:无血清筛选和上皮分离结合的方法可以获得纯化的口腔黏膜上皮细胞。第二部分生物钟基因Per2在不同口腔鳞癌细胞株及正常口腔黏膜上皮细胞中的表达目的:检测Per2在不同口腔鳞癌细胞株及正常口腔黏膜上皮细胞中的表达,为进一步实验提供依据。方法:采用QPCR和WB来检测Per2在上皮细胞、Tca8113和SCC15细胞中m RNA和蛋白的表达。统计学分析采用SPSS17.0数据软件对多组间实验数据采用单因素方差分析,结果以mean±SD表示,P0.05认为有统计学意义.结果:Per2在上皮细胞、Tca8113和SCC15细胞中m RNA和蛋白的表达:在上皮细胞、Tca8113和SCC15细胞中Per2 m RNA的表达分别为2.41±0.21,1.00±0.12和0.9±0.17;Per2蛋白表达的灰度值比值分别为:2.87±0.26,1.11±0.13和0.98±0.32。结论:Tca8113和SCC15细胞中Per2 m RNA和蛋白表达量均显著低于上皮细胞(P0.05),表明在OSCC中Per2低表达.第三部分Per2干扰质粒的构建和验证目的:通过sh RNA的方法干扰Per2,并检测干扰后的Per2 m RNA和蛋白的表达,建立Per2干扰的细胞模型,为进一步的研究做准备。方法:Per2真核干扰质粒(p GPU6-Per2-sh RNA-I~III)和空载质粒(p GPU6-Control-sh RNA)购买自成都冷泉水生物技术有限公司.细胞转染采用Lipo2000(Invitrogen,USA)和OPI-MEM(Gibco,USA)介导,细胞转染后24-48 h提取RNA,48 h后提取蛋白。将实验分为5组:Per2-sh RNA-I、Per2-sh RNA-II和Per2-sh RNA-III组分别为转染p GPU6-Per2-sh RNA-I,p GPU6-Per2-sh RNA-II和p GPU6-Per2-sh RNA-III质粒的Tca8113细胞。Control-sh RNA组(对照组)为转染空载质粒的Tca8113细胞。Tca8113组(空白对照组)为未做任何处理的Tca8113细胞。采用QPCR和WB来检测Per2在各组中m RNA和蛋白的表达。统计学分析采用SPSS17.0数据软件对多组间实验数据采用单因素方差分析,结果以mean±SD表示,P0.05认为有统计学意义.m RNA的表达分别为1.67±0.30、1.45±0.34、1.00±0.13、3.01±0.11和3.20±0.52。Per2蛋白表达的灰度值比值分别为1.52±0.11、1.22±0.15、0.87±0.21、3.18±0.52和3.21±0.42。Per2的m RNA和蛋白表达量在Tca8113和Control-sh RNA组中无明显差别(P0.05),Per2-sh RNA-Ⅲ组显著低于Tca8113和Control-sh RNA组(P0.05)。结论:Per2-sh RNA-Ⅲ组的Per2沉默效果最好,用于后续实验作为实验组。结果:Per2-sh RNA-Ⅰ~Ⅲ、Control-sh RNA和Tca8113组细胞中Per2第四部分Per2干扰后细胞的细胞周期分布.增殖和凋亡的变化及对细胞周期Cyclins-CDKs-CKIs网络的调控作用目的:本研究通过对人口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞内的Per2基因干扰,检测Per2干扰后细胞周期,增殖,凋亡的改变,并全面检测Cyclins-CDKsCKIs网络系统中各重要分子的改变情况,以进一步阐明Per2与癌症发生发展的关系.方法:将Per2真核干扰质粒转染入Tca8113细胞中,用流式细胞术检测细胞周期和凋亡的变化,QPCR检测Cyclin A2,Cyclin B1,C-myc,Cyclin D1,Cyclin E,P53,CDK1,CDK2,CDK4,CDK6,Rb1,E2F1,Wee1,cdc25,p16和p21的m RNA表达量的变化。统计学分析采用SPSS17.0数据软件对多组间实验数据采用单因素方差分析,结果以mean±SD表示,P0.05认为有统计学意义.结果:与Tca8113和Control-sh RNA组相比,Per2-sh RNA-Ⅲ组中G1/G0期的细胞数显著降低(P0.05),细胞增殖指数显著增高(P0.05),而凋亡指数显著降低(P0.05),Tca8113和Control-sh RNA组细胞的G1/G0期细胞数,增殖指数和凋亡指数无差异(P0.05)。与Tca8113和Control-sh RNA组相比,Per2-sh RNA-Ⅲ组中p53,p16和p21 m RNA的表达水平显著降低(P0.05),而Cyclin A2,Cyclin B1,Cyclin D1,CDK4,CDK6和E2F1 m RNA的表达水平显著增高(P0.05),C-myc,Cyclin E,CDK1,CDK2,cdc25,Wee1和Rb1 m RNA的表达水平均无差异(P0.05)?结论:Per2干扰后,Tca8113癌细胞中Cyclin A2,Cyclin B1,Cyclin D1,CDK4,CDK6,E2F1 m RNA的表达水平显著增高,而p53,p16,p21 m RNA的表达水平显著降低。细胞增殖水平显著增高,凋亡水平显著下降,细胞周期进程发生改变。本研究从转录水平证明了生物钟基因Per2对Cyclins-CDKs-CKIs细胞周期分子网络中的3方面及细胞周期G1/S检查点均有重要的调控作用,Per2是重要的抑癌基因。在此研究基础上,从蛋白质水平和蛋白翻译后修饰水平对Per2的深入研究有可能进一步明确昼夜节律与细胞周期两大周期活动之间的相互作用以及与癌变发生的关系,为癌症的治疗提供新的有效分子靶点。
【关键词】：口腔黏膜上皮细胞 Tca8113 SCC15 细胞培养 正常口腔粘膜上皮细胞 Tca8113 SCC15 Per2 shRNA 质粒 Per2 Tca8113 肿瘤 生物钟 Per2 细胞周期 口腔鳞癌
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.85
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-18
• 前言18-23
• 参考文献20-23
• 第一部分 口腔鳞癌细胞株培养和口腔黏膜上皮细胞的原代培养23-34
• 1 材料与方法23-29
• 2 实验结果29-31
• 3 讨论31-32
• 4 小结32
• 5 参考文献32-34
• 第二部分 生物钟基因Per2在不同口腔鳞癌细胞株及正常口腔黏膜上皮细胞中的表达34-47
• 1 材料和方法34-43
• 2 实验结果43
• 3 讨论43-45
• 4 小结45
• 5 参考文献45-47
• 第三部分 Per2干扰质粒的构建和验证47-64
• 1 实验材料和方法47-60
• 2 实验结果60-61
• 3 讨论61-62
• 4 小结62-63
• 5 参考文献63-64
• 第四部分 Per2干扰后细胞的细胞周期分布?增殖和凋亡的变化及对细胞周期Cyclins-CDKs-CKIs网络的调控作用64-88
• 1 材料和方法65-79
• 2 实验结果79-81
• 3 讨论81-83
• 4 小结83
• 5 参考文献83-88
• 全文总结88-89
• 文献综述89-111
• 参考文献99-111
• 致谢111-112
• 攻读博士学位期间发表的文章112

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本文编号：561418