变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因atpABCDEFGH突变的检测及意义

发布时间：2017-07-27 13:00

  本文关键词：变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因atpABCDEFGH突变的检测及意义

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【摘要】：目的： 龋病是危害人类身体健康的三大疾病之一，是牙体硬组织的慢性进行性感染性疾病，普遍发生于各个年龄段。在各种发病因素中，粘附在牙齿表面的牙菌斑是引起龋病发生发展的始动因子。牙菌斑中含有各种各样的细菌，细菌以口腔中的食物残留为为底物产酸，而变形链球菌作为主要病原菌，与龋病的发生、发展密切相关。从20世纪40年代开始，人们就开始陆续使用氟化物及其产品来防止龋病。氟化物防龋主要是因为氟化物能降低牙釉质脱矿程度、促进牙釉质再矿化；同时抑制口腔中致龋菌的生长和产酸过程。氟化物的防龋作用在很长一段时间内是真实有效的。但口腔中长期的局部高浓度氟环境可以引起变形链球菌耐氟菌株的出现。国内外学者研究证明变形链球菌耐氟菌株拥有更强的致龋性和对氟化物的抗性，这赋予了耐氟菌株在高氟环境下继续生存、产酸、促进牙釉质脱矿的能力，大大降低了氟化物防龋的效果。F0F1-ATP酶是由两个结构域构成的功能蛋白，可将变形链球菌细胞内ATP分解，产生的能量将细胞内的质子泵出细胞，维持细胞内PH值稳定，使细菌免受外界酸性环境的破坏而继续生存。已经有实验证明变形链球菌耐氟菌株的耐酸相关基因dltC，Dgk，comD，ccpA发生了个别位点的突变，可能与变形链球菌耐氟菌株相应蛋白功能活性增强密切相关，确切相关性有待后续研究。本实验对变形链球菌耐氟菌株另一耐酸相关基因atpABCDEFGH进行突变位点的检测，探究是否发生碱基突变，若碱基突变证明耐氟菌株F0F1-ATP酶活性增强是由于基因突变所致；若碱基未发生突变，则推测耐氟菌株F0F1-ATP酶活性增强是由于耐氟菌株在高氟环境下的适应性改变，或其他相关蛋白活性改变导致的连锁反应，具体机制有待研究。为研发更有效的防龋、治龋方法提供理论基础。 方法： 1.变形链球菌耐氟菌株UA159-FR的鉴定 2.UA159-FR全基因组提取 3.PCR扩增目的基因 4.重组质粒的构建：目的基因与PMD-18T载体连接，转化入大肠杆菌感受态细胞中。 5.质粒的提取，目的基因的鉴定 6.送检测序 结果： 1.实验用菌为UA159-FR鉴定成功 2.成功构建重组质粒 3.完成UA159-FR中atpABCDEFGH的基因序列测定，将测序结果与Genbank上公布的变形链球菌UA159的atpABCDEFGH序列进行对比发现:将S.mutans UA159-FR中的基因atpABCDEFGH与S.mutans UA159通过blastn比对，发现所有碱基均未发生突变。 结论： UA159-FR中基因atpABCDEFGH的序列测定成功，未发现突变位点。但国内外学者研究证明UA159-FR中的F0F1-ATP酶活性有所增强，本实验未发现突变位点，推测蛋白酶活性增强可能与基因甲基化有关，或者与其他相关蛋白功能改变有关。本实验证明F0F1-ATP酶活性增强与基因突变无关，但为进一步研F0F1-ATP酶的结构功能提供坚实的理论基础。
【关键词】：变形链球菌 耐酸相关基因atpABCDEFGH 基因突变
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781.1
【目录】：

• 附件4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 第1章 引言12-15
• 第2章 材料和方法15-55
• 2.1 实验材料15-16
• 2.1.1 细菌和载体15
• 2.1.2 仪器设备15
• 2.1.3 试剂及溶液15-16
• 2.2 实验方法16-23
• 2.2.1 设计引物16-17
• 2.2.2 S.mutans UA159-FR 的复苏，培养和鉴定17
• 2.2.3 FOREGENE 细菌 DNA 少量提取试剂盒提取 S.mutans UA159-FR 全基因组17-18
• 2.2.4 以 S.mutans UA159-FR 全基因组作为模板 PCR18-19
• 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物19
• 2.2.6 Magen 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收后 PCR 产物19-20
• 2.2.7 鉴定回收后 PCR 产物20
• 2.2.8 回收后 PCR 产物与 pMB18-T 载体连接20
• 2.2.9 连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中20-21
• 2.2.10 Magen 常规质粒提取试剂盒提取重组质粒21-22
• 2.2.11 重组质粒 PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定22-23
• 2.2.12 重组质粒送检测序23
• 2.2.13 该实验重复三次23
• 2.3 结果23-55
• 2.3.1 S.mutans UA159-FR 培养23-24
• 2.3.2 atpAB/C/D/EF/GH PCR 产物24-25
• 2.3.3 大肠杆菌培养25
• 2.3.4 重组质粒的提取与鉴定25-26
• 2.3.5 分析测序结果26-37
• 2.3.6 附图37-55
• 第3章 讨论55-61
• 3.1 S.MUTANS 及 S.MUTANS FR 的研究意义55-56
• 3.2 F0F1-ATP 酶的研究意义56-58
• 3.3 S.MUTANS FR 耐酸相关基因 ATPABCDEFGH 的研究意义58-59
• 3.4 基因突变的研究意义59-61
• 第4章 结论61-62
• 参考文献62-66
• 导师简介66-67
• 作者简介67-68
• 致谢68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 张志民;任宝华;张家颖;高心;王成坤;;变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dgk突变的检测及临床意义[J];吉林大学学报(医学版);2008年05期

2 刘莉;张志民;王丽颖;郑鹏;李会;;变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因gluA突变的检测及其意义[J];吉林大学学报(医学版);2011年01期

3 张志民;任宝华;张家颖;高心;王成坤;;变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dltC突变的检测及临床意义[J];口腔生物医学;2010年01期

4 盛江筠,刘正;变形链球菌和远缘链球菌耐氟菌株DNAG+C含量测定[J];上海口腔医学;2001年01期

5 盛江筠,黄正蔚,刘正;变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株质子移位膜ATP酶活性的比较[J];上海口腔医学;2005年01期

6 盛江筠,刘正;变形链球菌耐氟菌株的诱导及产酸性的实验研究[J];中华口腔医学杂志;2000年02期

7 黄晓晶,刘天佳,陈国弟,辛军平,陈舟;变形链球菌(血清型C)临床分离株AP-PCR基因分型[J];中华口腔医学杂志;2001年04期

8 于丹妮,陈锦英,殷晓萍,司进;变形链球菌耐氟株质子移位ATP酶活性的体外研究[J];中华医院感染学杂志;2005年01期

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本文编号：581511