耻骨松弛激素对TMJ髁状突软骨和骨代谢的影响及机制研究

发布时间：2017-07-31 05:02

本文关键词：耻骨松弛激素对TMJ髁状突软骨和骨代谢的影响及机制研究

【摘要】：颞下颌关节紊乱综合征(TMD)是一类累及颞下颌关节及周围咀嚼肌肉系统的疾病,严重TMD患者常发生髁状突关节软骨的退化和软骨下骨组织的破坏。TMD的发病率表现为女性显著高于男性,尤其在生殖期女性中达到高峰,然而其发病表现出明显性别和年龄特征的原因尚不清楚。尽管雌激素、雄激素、孕激素等生殖激素与TMD发病之间的相关性得到了广泛研究,但目前仍没有直接证据证明这些生殖激素和TMD相关,它们发挥作用的内在机制亦有待于进一步阐明。近年来,与分娩密切相关的耻骨松弛激素(RLN)逐渐走进了学者们的视野。RLN主要由雌性动物的卵巢、黄体等分泌,在分娩时发挥松弛盆腔韧带的生理学作用。RLN细胞学作用十分广泛：其不仅能诱导关节软骨细胞中基质金属蛋白酶如MMP1、MMP3、MMP9和MMP13的表达,促进胶原降解；还能作用于人造血祖细胞和成熟的破骨细胞,促进其分化和成熟。在以上细胞实验的基础上,本课题旨在探讨RLN在TMJ髁状突软骨和骨破坏过程中的作用并明确其相关机制。本研究第一部分旨在研究全身缓释RLN对小鼠髁状突软骨和骨的影响。我们应用ALZET微渗透泵通过全身缓释的方式投给RLN,4周后处死动物取其双侧髁状突并在体视显微镜下分离成关节软骨和骨两部分。在关节软骨方面,进行葡萄糖胺聚糖(GAGs)和胶原(collagen)含量测定以明确RLN对关节软骨主要成分的影响；HE染色观察髁状突关节软骨形态的改变；并应用基因芯片、免疫组织化学、RT-PCR、western blot等方法从基因和蛋白角度检测细胞外基质相关因子的改变。在骨组织方面,采用Micro CT观察RLN对髁状突骨量和骨结构的影响；并应用免疫组织化学、RT-PCR、western blot等方法检测破骨细胞数目以及功能的改变。实验结果显示：1.RLN作用后髁状突关节软骨中GAGs和collagen的含量减少,关节软骨变薄；2.RLN能上调关节软骨中多种金属蛋白酶的表达,其中MMP9和MMP13上升最为显著；3.RLN作用后,髁状突骨小梁数量变少、厚度变薄；4.RLN能使破骨细胞数目增加并刺激破骨细胞相关基因RANK、MMP9、Cathepsin K的表达；5.RLN促进RANKL的表达,从而使RANKL/OPG比例增加。综上,RLN一方面促进髁状突关节软骨降解,而MMP9、MMP13两种因子在这一过程中起关键作用；另一方面其能促进破骨细胞的生成、增强其活性从而引起髁状突骨小梁的破坏。第一部分研究结果提示MMP9和MMP13在RLN引起的髁状突关节软骨降解过程中发挥关键作用。在此基础上,本研究第二部分选用MMP9-/-和MMP13-/-小鼠模型,旨在明确MMP9和MMP13在RLN诱导的髁状突软骨和骨破坏过程中的精确作用。本研究在WT型、MMP9-/-、MMP13-/-三种基因型小鼠中分别投给RLN,具体实验方法和检测指标同第一部分。实验结果表明：1.在MMP9-/-小鼠中,RLN能刺激MMP13的代偿性增加,最终表现为和WT型小鼠相似的关节软骨降解现象；2.在MMP13-/-小鼠中,RLN虽能刺激MMP9的表达,但对关节软骨中GAGs、collagen含量及关节软骨厚度无影响；3.在WT型、MMP9-/-和MMP13-/-三种基因型小鼠中,RLN均能使髁状突骨小梁数量变少、厚度变薄；4.RLN增加破骨细胞数目以及对破骨细胞相关基因RANK、MMP9、CathepsinK的刺激作用在三种基因型小鼠中相似；5.RLN在三种基因型小鼠中均促进RANKL的表达,从而使RANKL/OPG比例增加。以上结果提示MMP9和MMP13在RLN诱导的关节软骨降解过程中存在一定的相互代偿作用,而MMP13的作用更为关键；MMP9和MMP13在RLN诱导的破骨细胞生成和骨吸收方面均不起决定性作用。RLN受体-松弛素家族肽(RXFP)的水平直接决定了RLN的生物学功能。RXFP包括RXFP1-4四个成员,其中RLN能与RXFP1和RXFP2结合。有报道提出RLN与RXFP1具有高度亲和力而和RXFP2亲和性较低,而RXFP1和RXFP2介导的生物学作用显著不同。本课题第三部分旨在确定RXFP1和RXFP2两种受体在RLN诱导的髁状突软骨和骨破坏过程中的具体作用。我们分别设计合成shRNA-RXFP1和shRNA-RXFP2'慢病毒颗粒,并将其注射到小鼠颞下颌关节腔内,以期建立髁状突局限性RXFP1和RXFP2沉默小鼠模型。首先应用RT-PCR和western blot检测正常型、shRXFP1、shRXFP2三种小鼠髁状突组织中RXFP1和RXFP2的表达水平,以验证慢病毒颗粒的特异性和效果。在此基础上,我们分别检测了三种动物投给RLN前后髁状突关节软骨中GAGs、collagen的含量,MMP9、MMP13的表达情况以及髁状突骨组织的含量和破骨细胞功能等,具体方法同第一部分。此外,我们通过RT-PCR检测了三种动物在RLN的作用下髁状突骨组织中ALP、COLI、OCN、TGF-β、OPN等成骨相关基因的表达情况。实验结果表明：1. shRXFP1和shRXFP2小鼠分别表现为髁状突RXFP1和RXFP2受体表达的特异性减弱,且减弱程度不受RLN影响；2. shRXFP1小鼠经RLN作用后髁状突关节软骨中GAGs、collagen的含量及MMP9、MMP13的表达均无明显变化；并且RLN对shRXFP1小鼠髁状突骨量和破骨相关基因的表达无明显影响；3. shRXFP2小鼠经RLN作用后髁状突关节软骨和骨组织的改变与正常型小鼠基本相似；4. shRXFP2小鼠较正常型小鼠髁状突骨小梁明显减少,骨质结构较为稀疏,成骨相关基因ALP、COLI、OCN表达减弱；5.RLN能刺激shRXFP1小鼠成骨相关基因的表达,而在正常型和shRXFP2小鼠中RLN对成骨相关基因无作用。以上结果提示RXFP1介导了RLN的关节软骨降解作用和骨吸收功能；RXFP2可能在成骨细胞活性的调节中发挥重要的作用。综上,RLN能促进髁状突关节软骨的降解和小梁骨的吸收,可能是TMD发病的重要刺激因素。本研究为深入探讨TMJ髁状突破坏的病理机制提供了实验基础和崭新的研究思路。
【关键词】：髁状突 耻骨松弛激素 基质金属蛋白酶 破骨细胞 RANKL/OPG
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R782.6
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