利用PFKFB3的生物节律性有效抑制舌癌进程的调控机制

发布时间：2017-08-05 11:10

  本文关键词：利用PFKFB3的生物节律性有效抑制舌癌进程的调控机制

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【摘要】：1.研究背景与目的 生物节律性对生物体的行为学和生理学的调控起着至关重要的作用,越来越多的证据已经证实,生物节律性紊乱可以提高致癌风险。轮班制工作,飞行时差反应,夜间光污染等均被列为引起生物节律性紊乱的因素。此外,生物节律性是否正常也可以作为一个独立影响因子,对癌症患者的预后具有预测性。基于上述依据,有学者提出时间疗法这一概念。由于癌症细胞与正常体细胞表现出不同的生物节律性,所以时间疗法即是利用这种差异,而给癌症患者安排药物或物理治疗时间的方法。而这一疗法在癌症综合治疗及个性化治疗中具有较好的应用前景已被众多研究证实。然而,生物钟紊乱对口腔相关疾病影响的研究尚较少。 近年来,PFKFB3及其产物iPFK2备受关注,因为其被证实为PFKFB家族中作用最强的激酶。iPFK2可以通过促进PFK1,这一糖酵解限速酶的功能,从而大大提高糖酵解反应的速率。而早在1927年,学者Otto Warburg即研究证实,即使在供氧充足的条件下,癌症细胞生物代谢所需能量的80%仍来源于无氧代谢——糖酵解过程,此经典供能模式被称为"Warburg效应”。同时,大量临床证据已证实,PFKFB3在众多癌症组织中都呈现出高表达。针对PFKFB3研发出的小分子抑制剂3PO已被作为单一靶向治疗药物正式进入临床试验阶段。可见,PFKFB3在癌症细胞能量代谢中扮演着极其重要的角色。 然而,目前为止,并无相关研究探究生物节律性的紊乱或者PFKFB3本身的生物节律性是否会影响癌症的发生和发展。如果能够找出PFKFB3的生物节律性与口腔癌症之间的相互作用,并PFKFB3为药物靶点,将时间疗法应用于口腔癌症的治疗中,无疑是为口腔癌症的综合治疗及个性化治疗提供了一个全新的思路。 2.研究材料与方法 (1)将购买获得的人舌癌细胞系SCC9增殖培养后,采用血清饥饿处理的方法同步化,分6个时间点分别收集细胞,裂解后提取细胞的RNA,采用RT-PCR的方法探索该细胞PFKFB3, CLOCK, Bmal1, Per1以及Per2的生物节律性： (2)采用基因测序的方法获得PFKFB3启动子全序列,并利用软件定位出启动子上所有E-boxes的位置：利用质粒转染和荧光素酶报告检测技术证实CLOCK、Bmal1及其复合物对PFKFB3表达的调控机制,及在不同时间点下PFKFB3的表达差异； (3)以SCC9为细胞模型,以3PO为PFKFB3的靶向抑制剂,利用RT-PCR.细胞流式等技术,体外证实不同时间点下,3PO抑制PFKFB3表达的能力是否有所差异,以及时间疗法对细胞生物行为的影响。 3.研究结果 (1) PFKFB3基因在舌癌细胞中表达具有明显的生物节律性,具有早晨表达被促进,夜间表达被抑制的规律。生物钟核心正反馈基因CLOCK在舌癌细胞表达的生物节律性与PFKFB3基因极其相似；而生物钟核心正反馈基因Bmal1表达紊乱,持续被抑制在极低水平；生物钟核心负反馈基因Per1及Per2在舌癌细胞中表达的生物节律性具有双高峰; (2) PFKFB3启动子上有33个E-box,其中包括一个严格的Bmal1/CLOCK复合体结合位点(CACGTGA),同时证实,CLOCK/Bmal1复合体对PFKFB3转录翻译的调控规律为：增加CLOCK的表达,可显著提高PFKFB3基因的转录水平：而这种作用会被Bmal1抑制;将CLOCK变异后,PFKFB3基因的表达几乎接近正常细胞水平；因此PFKFB3基因的节律性表达中,CLOCK起的作用更为关键； (3)体外不同时间点给予舌癌细胞PFKFB3抑制剂3PO刺激,ZT7时癌细胞的增殖能力可被显著抑制,凋亡能力可被显著促进;而ZT19这一时间点下,药物效果无显著差异；同时,在两个时间点下,PFKFB3抑制剂3PO对舌癌细胞的细胞周期均无明显的影响。 4.研究结论 本研究首次从细胞的基因水平证实,PFKFB3在舌癌细胞中不仅表达量增高,而且具有生物节律性,这一生物节律性极有可能受到CLOCK/Bmal1复合体的直接调控,其中CLOCK可能占有更为主导的优势。同时,本研究通过体外实验验证了这一结论,并证实ZT7时间点下应用抗癌药物3PO,更有助于抑制细胞的增殖,促进细胞的凋亡,从而将抗癌药效最大化,为时间治疗在口腔癌症治疗中的应用提供了理论依据。
【关键词】：PFKFB3 生物钟紊乱 舌癌 CLOCK Bmall 3PO 时间疗法
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.86
【目录】：

• 缩略词表7-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-17
• 引言17-22
• 参考文献20-22
• 第一部分 舌癌细胞中PFKFB3及核心生物钟基因生物节律性的检测22-42
• 1. 材料23-24
• 2. 方法24-29
• 3. 结果29-32
• 4. 讨论32-34
• 5. 小结34
• 参考文献34-42
• 第二部分 生物钟核心基因CLOCK/Bmal1对PFKFB3转录翻译的调控及其机制42-60
• 1. 材料43-45
• 2. 方法45-52
• 3. 结果52-55
• 4. 讨论55-56
• 5. 小结56
• 参考文献56-60
• 第三部分 体外探查利用PFKFB3的生物节律性有效抑制舌癌进程的机制60-75
• 1. 材料61-62
• 2. 方法62-65
• 3. 结果65-71
• 4. 讨论71-72
• 5. 小结72
• 参考文献72-75
• 全文结论75-77
• 综述77-95
• 参考文献84-95
• 附件95-102
• 致谢102-104

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本文编号：624568