自噬对热诱导舌鳞癌Cal-27细胞凋亡的调节作用研究

发布时间：2017-08-20 11:28

  本文关键词：自噬对热诱导舌鳞癌Cal-27细胞凋亡的调节作用研究

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【摘要】：[目的]探索自噬对热诱导口腔舌鳞癌Cal-27细胞凋亡作用的影响,为通过促进或抑制细胞自噬作用提高热疗治疗效果提供实验依据。[方法](1)用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,置37-C、5%CO2的培养箱中培养Cal-27细胞。 (2)实验分组：对照组(Cal-27细胞)、加热组(42℃100min及43℃100min处理Cal-27细胞)、自噬促进剂雷帕霉素组(100nnM雷帕霉素37℃100min处理Cal-27细胞)、自噬抑制剂3-MA组(5mM 3-MA 37℃100min处理Cal-27细胞)、自噬促进剂+加热组(100nM雷帕霉素+43℃100min处理Cal-27细胞)、自噬抑制剂+加热组(5mM 3-MA+43℃100min处理Cal-27细胞)。(3)化学免疫荧光检测细胞内自噬相关蛋白Beclin-1。(4)透射电子显微镜观察正常培养及热诱导后细胞内自噬小体数量的变化。(5)Annexin V-FITC/PI标记流式细胞仪检测细胞凋亡率。(6)免疫印迹法检测Bax、Beclin-1、 LC3、Atg5蛋白表达量。(7)SPSS17.0统计软件对数据进行统计学分析。[结果](1)化学免疫荧光实验发现对照组与加热组在荧光显微镜下均能观察到自噬相关蛋白Beclin-1的表达,42℃100min加热组Beclin-1的表达较对照组增强。 (2)电子显微镜下观察对照组细胞可发现内单层膜包裹废用细胞器的自噬小体,但数量较少；42℃100min加热时,Cal-27细胞内自噬小体的数量明显多于对照组,可见大量的单层膜结构自噬小体,包绕着废用的细胞器,如线粒体,高尔基体等,部分被包裹细胞器已进入分解中后期,细胞内其他细胞器形态良好；43℃100min加热时,细胞内自噬小体的数量较42℃100min加热时有所减少,且线粒体呈现肿胀状态,部分细胞出现凋亡形态改变。(3)流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果显示：对照组Cal-27细胞凋亡率为(1.29±0.05)%；自噬促进剂雷帕霉素处理组细胞凋亡率为(2.18±0.04)%,自噬抑制剂3-MA处理组细胞凋亡率为(3.71+0.10)%,雷帕霉素和3-MA处理组与对照组相比,凋亡率差异不具有统计学意义(P0.05)。43℃100mmin加热组Cal-27细胞凋亡率为(29.63±0.03)%,与对照组相比,凋亡率明显高于对照组,统计学上有显著差异(P0.05)：自噬促进剂雷帕霉素+43℃100min加热组细胞凋亡率为(18.98±0.06)%,与43℃100min加热组相比,凋亡率明显降低,且差异有统计学意义(P0.05)；自噬抑制剂3-MA+43℃100min加热组细胞凋亡率为(38.92±0.28)%,细胞凋亡率明显高于加热组,差异有统计学意义(P0.05)。(4)化学免疫印迹检测发现：单独加入雷帕霉素或3-MA,升高或降低细胞的自噬作用,LC3II/LC3I比值及Beclin-1、Atg5、Bax的表达量与对照组相比,无明显变化,差异无统计学意义(P0.05)；43℃100min加热时,LC3ⅡI/LC3I比值,Beclin-1、Atg5的表达量较对照组相比,明显下降,差异有统计学意义(P0.05),Bax的表达量较单独43℃100min加热组升高,差异有统计学意义(P0.05)；雷帕霉素+43℃100min加热组,LC3II/LC3I比值,Beclin-1、Atg5的表达量较43℃100min加热组明显上升,差异有统计学意义(P0.05),Bax的表达量较43℃100min加热组降低,差异有统计学意义(P0.05)；3-MA+43℃100min加热组,LC3II/LC3I比值,Beclin-1、Atg5的表达量较43℃100min加热组明显下降,差异有统计学意义(P0.05),Bax的表达量较43℃100min加热组升高,差异有统计学意义(P0.05)。[结论]加温可诱发舌鳞癌Cal-27细胞发生自噬。提高细胞自噬水平,会抑制热诱导细胞凋亡发生,降低热杀伤肿瘤细胞作用；反之,降低细胞自噬水平,会促进热诱导细胞凋亡发生,提高热杀伤肿瘤细胞作用。
【关键词】：舌鳞癌 Cal-27细胞 热疗 自噬 凋亡
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.86
【目录】：

• 英文缩略表5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 材料和方法14-22
• 1. 主要试剂14-15
• 2. 主要设备15-16
• 3. 主要溶液配制16-17
• 4. 实验方法17-21
• 4.1 细胞培养17
• 4.2 细胞冻存17
• 4.3 细胞复苏17
• 4.4 实验分组17-18
• 4.5 免疫荧光实验18
• 4.6 透射电子显微镜观察18-19
• 4.7 细胞凋亡率检测19
• 4.8 免疫印迹实验19-21
• 5 统计学分析21-22
• 结果22-40
• 讨论40-45
• 结论45-46
• 参考文献46-48
• 综述48-56
• 参考文献54-56
• 攻读学位期间发表文章情况56-57
• 致谢57

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本文编号：706380