炎症微环境下组蛋白去乙酰化对牙周膜干细胞再生能力的影响

发布时间：2017-08-27 04:27

  本文关键词：炎症微环境下组蛋白去乙酰化对牙周膜干细胞再生能力的影响

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【摘要】：牙周疾病是口腔最常见的疾病之一,严重危害牙周健康和口腔健康,其中牙周炎是一类由牙菌斑生物膜引起的牙周组织的慢性感染性疾病,可引起牙周膜、牙槽骨和牙骨质等牙周支持组织的破坏,导致炎症发生及牙周袋形成、进行性附着丧失、和牙槽骨吸收,严重时甚至会导致牙齿松动脱落,此外,牙周炎与全身健康也有着密切的关系。目前,尚没有有效的手段对牙周病进行根治。牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是一类存在于牙周组织的间充质干细胞,已被证实为牙周组织再生重要的种子细胞。众所周知,基质微环境的细胞内信号和细胞外信号共同调节干细胞的自我更新和多向分化潜能,而炎症不仅改变了干细胞基质微环境的平衡,还能影响其内源性信号的调控作用。研究表明,炎症微环境下PDLSCs的再生能力减弱,因此,如何改善或恢复因微环境改变而引起的PDLSCs下降的成骨能力成为牙周再生的一个新思路。前期研究发现,表观遗传机制与微环境的改变有密切的关系,而组蛋白去乙酰化作为表观修饰中一种重要的调控机制,在牙周病的发生和发展过程中发挥重要作用。组蛋白去乙酰化动态平衡由组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)和组蛋白乙酰基转移酶(Histone acetyl transferases,HATs)共同维持,而组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitors,HDACIs/HDIs)被发现可促进成骨细胞分化成熟,抑制破骨细胞生成和炎性介质的产生,对骨再生具有正向调控作用。因此本实验首先分别从健康牙周膜组织和牙周炎症牙周膜组织中分离纯化出PDLSCs,比较HDACs在两种不同来源的干细胞中的表达差异;其次利用HDACIs(NaB和TSA)抑制HDACs功能后,探究其在炎症微环境下对PDLSCs成骨分化和骨形成能力的影响;最后建立大鼠牙周炎模型,检测NaB和TSA对牙周炎引起的牙槽骨缺失的影响,为探究基于干细胞的牙周组织再生治疗提供一种新思路,也为临床牙周炎的治疗探索新的潜在治疗药物。第一部分健康组织和炎症组织来源的PDLSCs的分离培养与鉴定及生物学特性的研究目的体外分离培养H-PDLSCs和P-PDLSCs,并对两种细胞的生物学特性进行鉴定和比较。方法(1)有限稀释法单克隆分离培养获取正常和慢性炎症组织来源的PDLSCs(2)流式细胞术检测两种间充质干细胞的表面分子标志物的表达(3)MTT、克隆形成实验对两种间充质干细胞的增殖能力进行检测并比较(4)成骨、成脂分化诱导实验检测并比较两种干细胞的多向分化能力结果(1)实验中成功获取了H-PDLSCs和P-PDLSCs,镜下观察均有间充质干细胞的形态,有限稀释法培养有细胞克隆形成,具有自我更新能力。(2)流式细胞仪检测结果显示,两种细胞的间充质干细胞特异性表面分子标记物STRO-1、CD105、CD90和CD146均为强阳性表达,造血干细胞分子标记物CD34和CD45阴性表达。(3)MTT检测发现炎症组织来源的PDLSCs增殖能力高于正常组织来源的PDLSCs;克隆形成实验结果表明,炎症组PDLSCs克隆形成率明显高于正常组。(4)成骨、成脂分化诱导实验结果显示,在一定条件下,两种不同来源的PDLSCs均有骨向分化和脂向分化能力,但炎症组的PDLSCs成骨分化能力较正常组有明显的下降,而两者的成脂分化能力差异并不显著。结论(1)H-PDLSCs和P-PDLSCs为间充质干细胞,具有自我更新能力和多向分化潜能。(2)炎症微环境影响了干细胞的生物学特性,牙周炎症组织来源的PDLSCs成骨分化能力减弱。第二部分NaB和TSA对P-PDLSCs骨向分化能力的影响目的检测炎症微环境下PDLSCs中HDACs的表达变化,筛选合适浓度的HDACIs(NaB和TSA)进行加药处理,检测NaB和TSA抑制HDACs功能后对H-PDLSCs和P-PDLSCs成骨分化能力的影响,并初步探讨其所作用的组蛋白乙酰化位点。方法(1)利用RT-PCR技术检测正常微环境和炎症微环境下PDLSCs中HDAC1-11的表达差异,筛选一种特异性变化的HDAC-X,然后通过Western blot检测验证,以此筛选出特异性的HDAC-X,并进行后续实验。(2)分别设置NaB和TSA不同的药物浓度梯度,通过Western blot检测选择本实验应用的合适浓度。(3)MTT法检测两种HDACIs对PDLSCs增殖能力的影响,并于倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化。(4)对各组进行成骨分化诱导,通过ALP染色和茜素红染色比较各组ALP活性和基质矿化能力的变化,利用Western blot检测各组成骨相关蛋白的表达。(5)免疫组织化学分别检测NaB和TSA在P-PDLSCs细胞膜片中的应用。(6)分别用NaB和TSA处理P-PDLSCs 24h后Western blot检测HDAC9及下游组蛋白乙酰化修饰位点的变化。结果(1)RT-PCR检测结果显示,炎症微环境下HDACs的表达普遍升高,以HDAC9的升高最为显著,Western blot检测证明P-PDLSCs中HDAC9的蛋白表达增多。(2)利用不同浓度的NaB和TSA处理细胞后,通过Western blot检测选择本次实验的药物浓度:NaB100μM和TSA100n M。(3)MTT检测结果显示,NaB和TSA对PDLSCs增殖能力无影响;倒置显微镜下观察细胞生长状态良好,细胞形态无异常,镜下无死细胞形成。(4)通过ALP染色、茜素红染色和Western blot检测发现,NaB和TSA能促进H-PDLSCs和P-PDLSCs的基质矿化能力和成骨相关蛋白的表达。(5)免疫组化结果显示,NaB和TSA明显增强P-PDLSCs细胞外基质成骨相关指标Runx2的分泌。(6)分别用NaB和TSA作用于PDLSCs后可见HDAC9表达均下降,NaB处理后乙酰化组蛋白H3K9、H3K18、H4K16的表达升高,以H4K16的升高最明显;TSA处理后,可见H3K18表达升高。结论(1)炎症微环境下PDLSCs中HDACs的表达普遍升高,组蛋白去乙酰化状态失衡。(2)在适宜的安全浓度下,NaB和TSA均能增强H-PDLSCs和P-PDLSCs的成骨分化能力。(3)NaB和TSA作为广谱的HDACIs,可作用于H4K16、H3K18等乙酰化位点。第三部分NaB和TSA在P-PDLSCs裸鼠体内异位移植和SD大鼠原位牙周再生中的研究目的探讨NaB和TSA在体内异位成骨和原位成骨中的作用。方法(1)制备各组PDLSCs细胞膜片,裸鼠皮下移植8周后取材,经HE染色观察各组新生骨生成情况。(2)利用LPS构建SD大鼠牙周炎模型,分别局部注射NaB和TSA,Micro-CT观察各组牙槽骨缺损的情况。结果(1)经体内裸鼠皮下移植实验结果显示,NaB和TSA均可显著促进P-PDLSCs的新骨生成能力。(2)Micro-CT结果显示,NaB和TSA明显抑制SD大鼠牙周炎引起的牙槽骨缺失。结论NaB和TSA能显著改善P-PDLSCs的成骨分化和骨再生能力,并能明显抑制牙周炎引起的牙槽骨吸收。
【关键词】：组蛋白去乙酰化 牙周膜干细胞 炎症微环境 成骨分化 NaB TSA
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781.4
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-20
• 文献回顾20-29
• 第一部分 健康组织和炎症组织来源的PDLSCs的分离培养与鉴定及生物学特性的研究29-41
• 1 实验材料29-31
• 2 实验方法31-34
• 3 实验结果34-39
• 4 讨论39-41
• 第二部分 NaB和TSA对P-PDLSCs骨向分化能力的影响41-65
• 实验一 HDAC的筛选及NaB和TSA药物浓度的选择42-54
• 1 实验材料42-43
• 2 实验方法43-48
• 3 实验结果48-52
• 4 讨论52-54
• 实验二 NaB和TSA对P-PDLSCs成骨分化能力的影响54-62
• 1 实验材料54-55
• 2 实验方法55-57
• 3 实验结果57-60
• 4 讨论60-62
• 实验三 NaB和TSA影响P-PDLSCs组蛋白乙酰化作用靶点的初步探讨62-65
• 1 实验材料62
• 2 实验方法62-63
• 3 实验结果63
• 4 讨论63-65
• 第三部分 NaB和TSA在P-PDLSCs裸鼠体内异位移植和SD大鼠原位牙周再生中的研究65-73
• 实验一 NaB和TSA在P-PDLSCs体内异位移植实验中的研究66-69
• 1 实验材料66
• 2 实验方法66-67
• 3 实验结果67-68
• 4 讨论68-69
• 实验二 NaB和TSA在SD大鼠原位牙周再生中的研究69-73
• 1 实验材料69
• 2 实验方法69-70
• 3 实验结果70-71
• 4 讨论71-73
• 小结73-75
• 参考文献75-85
• 个人简历和研究成果85-86
• 致谢86

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本文编号：744377