HSP90α蛋白抑制剂17-AAG联合热疗诱导口腔舌鳞癌Tca8113细胞凋亡的研究

发布时间：2017-08-30 17:44

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【摘要】：[目的]探索HSP90 α蛋白抑制剂17-AAG联合热疗诱导口腔舌鳞癌Tca8113细胞凋亡的作用及相关分子机制。[方法](1)细胞培养：用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,置37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养Tca8113细胞。(2)实验分组：(a)常规培养Tca8113细胞,43℃80min热诱导处理后分别培养3h、6h、12h、24h、48h; (b)①对照组(常规培养Tca8113细胞)；②热诱导组(43℃ 80min热诱导处理Tca8113细胞)③17-AAG组(10μg/ml 17-AAG处理Tca8113细胞)④17-AAG+热诱导组(10μg/ml17-AAG+43℃ 80min热诱导处理Tca8113细胞)。(3)蛋白免疫印迹法检测热诱导Tca8113细胞后HSP90α蛋白表达的动态变化。(4)倒置显微镜观察细胞形态。(5)CCK8法检测细胞增殖抑制率。(6)Annexin V-FITC/PI荧光标记,流式细胞仪检测Tca8113细胞凋亡率。(7)JC-1染色,流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位。(8)酶标仪检测各组细胞Caspase-3相对活性。(9)免疫印迹检测Bcl-2和Bax蛋白相对表达量的变化及PKC-8蛋白的断裂活化情况。(10)SPSS17.0统计软件对数据进行统计学分析。[结果](1)免疫印迹检测发现,对照组Tca8113细胞中HSP90a相对表达量为(0.14±0.01)；加热后3h组为(0.15±0.02),较对照组未有明显统计学差异(p0.05)；加热后6h组为(0.20-0.01),较对照组未有明显统计学差异(p0.05)；加热后12h组为(0.72-0.06),较对照组表达升高(P0.05)；加热后24h组为(0.89±0.14),较对照组表达明显升高(P0.01)；加热后48h组为(0.46±0.05),较对照组表达升高(P0.05)。(2)倒置显微镜观察细胞形态发现：热诱导组Tca8113细胞变圆、皱缩,浮起状。17-AAG组,细胞贴壁不均匀,部分细胞脱落。药热联合组,大量细胞皱缩、变圆,形态不规则,部分细胞碎裂漂浮于培养基中。(3)CCK8检测细胞增殖抑制率发现：热诱导组Tca8113细胞增殖抑制率为(12.93±3.07)%,17-AAG组细胞增殖抑制率为(16.85±2.79)%,药热联合组细胞增殖抑制率为(35.05±8.23)%。17-AAG组与热诱导组比较,差异无明显统计学差异(p0.05)。药热联合组与17-AAG组或热诱导组比较,差异有统计学意义(p0.05)。(4)流式细胞仪检测细胞凋亡率,对照组Tca8113细胞凋亡率为(3.19±0.89)%,热诱导组处理Tca8113细胞24小时后凋亡率为(10.57±0.80)%,与对照组相比,有统计学差异(P0.05)； 17-AAG处理Tca8113细胞24小时后凋亡率为(20.99±1.65)%,与对照组相比,统计学上有显著差异(P0.05)；药热联合处理细胞24小时后凋亡率为(40.67±2.04)%,明显高于热诱导组或17-AAG组(P0.05)。(5)线粒体膜电位检测结果：对照组Tca8113细胞线粒体膜JC-1单体含量为(5.67±1.20)%；热诱导组为(20.49±2.12)%,17-AAG组为(31.89±1.31)%,药热联合组为(55.09±3.43)%,热诱导组或17-AAG组与对照组相比差异有统计学意义(P0.05),药热联合组明显高于热诱导组或17-AAG组(p0.05)。(6)活化Caspase-3检测结果：对照组Tca8113细胞活化Caspase-3比值为(1.04±0.09)%,热诱导组比值为(3.21±0.17)%,与对照组相比,有统计学差异(P0.05)： 17-AAG组比值为(5.16±0.23)%,与对照组相比,有统计学差异(P0.05)；药热联合组比值为(8.45±0.58)%,明显高于热诱导组和17-AAG组(P0.05)。(7)免疫印迹检测结果：①对照组Tca8113细胞Bcl-2相对表达量为(1.06±0.07)；热诱导组为(0.60±0.02),较对照组表达降低(P0.05)；17-AAG组为(0.74±0.03),较对照组表达降低(P0.05)；药热联合组为(0.43±0.04),较对照组表达明显降低(P0.05)。②对照组细胞Bax相对表达量为(0.62+0.03)；热诱导组为(0.94±0.13),较对照组表达升高(P0.05)；17-AAG组为(1.21±0.11),较对照组和热诱导组表达升高(P0.05)；药热联合组为(1.72±0.21),较其余各组表达明显升高(P0.05)。③17-AAG组细胞PKC-8相对表达量为(0.42±0.20),与对照组(0.77±0.11)比较,PKC-8表达降低(P0.05)；药热联合组(0.42±0.18)与对照组比较,PKC-8表达明显降低(P0.05)。④17-AAG组细胞PKC-δ的断裂活化片段PKC-8 CF相对表达量为(0.50±0.04),与对照组(0.32±0.10)或热诱导组(0.32±0.07)比较,PKC-8 CF表达升高(P0.05)；药热联合组为(0.74±0.05),与各组比较,PKC-8 CF表达明显升高(P0.05)。[结论]Hsp90α蛋白抑制剂17-AAG联合热疗能够诱导口腔舌鳞癌Tca8113细胞凋亡的发生,下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达,促进PKC-δ蛋白的断裂活化。
【关键词】：HSP90α蛋白 17-AAG Tca8113细胞 热疗 细胞凋亡
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.8
【目录】：

• 英文缩略表5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 材料和方法14-22
• 一、主要试剂、设备及材料14-16
• 1. 主要试剂14-15
• 2. 主要设备15-16
• 3. 细胞株16
• 4. 试剂配制16
• 二、实验方法16-22
• 1. 细胞培养16
• 2. 热诱导处理16
• 3. 实验分组16-17
• 4. 细胞形态观察17
• 5. 细胞增殖抑制率检测17
• 6. 细胞凋亡率检测17-18
• 7. 线粒体膜电位检测18
• 8. Caspase-3活性检测18-19
• 9. 免疫印迹(Western Blot)19-21
• 10. 统计学分析21-22
• 结果22-37
• 一、HSP90α免疫印迹检测结果22-23
• 二、细胞形态观察结果23-24
• 三、细胞增殖抑制率结果24-25
• 四、流式细胞仪检测细胞的凋亡率结果25-27
• 五、线粒体膜电位检测结果27-29
• 六、Caspase-3活性检测结果29-31
• 七、Bcl-2、Bax、PKC-δ疫印迹检测结果31-37
• 讨论37-43
• 结论43-44
• 参考文献44-47
• 综述47-55
• 参考文献53-55
• 攻读学位期间发表文章情况55-56
• 致谢56

【共引文献】

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本文编号：760740