咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠深层咬肌影响的研究

发布时间：2017-08-30 19:09

  本文关键词：咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠深层咬肌影响的研究

  更多相关文章： 咬合垂直距离升高 深层咬肌 重链肌球蛋白 MyoD myogenin

【摘要】：目的：适合稳定的咬合垂直距离(occlusal vertical dimension,OVD)对于充分发挥咀嚼肌的咀嚼效能,减少咀嚼肌的损伤以及维持面部平衡协调至关重要。同时,正常的肌肉结构与功能是维持正常咬合垂直距离的解剖基础。在正畸临床治疗过程中,经常遇到对深覆牙合病人进行升高咬合垂直距离(increasing occlusal vertical dimension,i OVD)的情况。虽然对于大多数患者来说,治疗是成功的,但临床上也有一部分患者出现深覆牙合复发的情况。其中持肌肉学派观点的学者认为建立适当的功能性肌平衡对于矫治的稳定是非常重要的,保持期的长短取决于组织结构和功能的改建。因此,据此推测,咬合升高后肌肉的结构和功能未发生相应的适应性改变可能是导致深覆牙合复发的重要原因之一。咬肌作为咀嚼肌群中最主要的升颌肌,其功能的发挥与咬合垂直距离密切相关。咬合垂直距离的增加又势必造成咬肌纤维拉伸,机械负载增加。哺乳动物的骨骼肌具有高度可塑性,在肌肉负载变化的情况下可以在生理允许范围内发生解剖、生理、组织化学及生物化学特性的改变,使其对能量的需求最优化,最终使肌肉组织在组织结构及生理功能上与机体的改变相适应。咬合垂直距离增加后咬肌是否会发生与其它骨骼肌拉伸后相似的变化仅有少量报道;同时,咬合升高对于成年实验动物的影响尚未见报道。本研究拟通过建立咬合垂直距离升高的动物模型,研究咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠深层咬肌的影响,初步探讨咬合垂直距离升高对咬肌影响的分子信号机制,为研究正畸临床对不同年龄患者进行咬合垂直距离升高后肌肉的变化和矫治远期的稳定性提供相关的理论依据。方法:第一部分咬合垂直距离升高动物模型的建立1实验动物及分组48只雄性Wistar大鼠按照月龄分为两组:青少年组(1.5月龄)及年轻成年组(8月龄),每组24只。两组内又分别设置对照组与实验组两个亚组,每组12只。即按照年龄及是否进行实验干预将实验动物分为青少年对照组(teenager control group,group TC),青少年实验组(teenager experimental group,group TE),年轻成年对照组(young adult control group,group YAC),年轻成年实验组(young adult experimental group,group TE)。实验组大鼠上颌佩戴咬合板升高咬合,对照组仅进行操作对照。2咬合垂直距离升高的方法实验组动物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,麻醉剂量为0.3ml/100g体重。隔湿,使用35%磷酸酸蚀双侧上颌磨牙牙合面20秒。流水冲洗后涂布粘接剂,光照10秒。双侧第一磨牙合面堆塑树脂以升高咬合,使上颌第一磨牙区咬合板高度为1.5mm,第三磨牙区咬合板高度为1mm,光照20秒,使用慢速打磨机去除咬合早接触点。3操作对照的方法对照组与实验组采用同样麻醉方法麻醉,仅作后牙牙合面酸蚀,但不放置咬合板,即仅进行操作对照。4咬合升高动物模型建立的评价4.1动物的一般情况的观察实验期间每天固定时间点分两次记录两组动物一般情况,包括:咬合板的存留情况、大鼠的行为学变化及体重变化。4.2牙牙合变化观察每日定时对大鼠牙牙合变化进行观察,并于咬合升高前(T0)、咬合升高当天(T1)、咬合升高7天(T7)及14天(T14)进行数码相片的拍摄。4.3头颅侧位片观察于T0、T1、T7及T14四个时间节点拍摄各组大鼠头颅侧位片,通过FUJI PRIMA Console软件对X光片进行定点并对咬合垂直距离(VT间距)进行测量,每一张X线片由不同观察者重复测量两次。通过比较同一年龄组内咬合升高组与对照组间的咬合垂直距离的差异以及不同年龄组间咬合升高前后垂直距离的变化鉴定模型是否建立成功。4.4 HE染色观察于实验观察节点7天、14天分别处死不同年龄实验组和对照组大鼠各6只,立即于大鼠的深层咬肌中央进行取材,组织块大小为8mm×5mm×3mm,异戊烷液氮速冻, 80℃超低温冰箱冻存。使用HE染色观察咬合升高对咬肌影响。第二部分咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠深层咬肌组织形态结构的影响1实验动物分组及动物模型建立同第一部分2标本留取用于组织化学染色的咬肌标本的采集及处理方法同第一部分。电镜标本留取组织块大小为1mm×1mm×3mm,4%戊二醛固定2小时后送检。3组织化学分析使用三磷酸腺苷酶染色(ATPase)及还原型辅酶Ⅰ四氮唑还原酶(NADH-TR)染色后光镜下观察肌纤维形态,使用Image-Pro Plus软件计数咬肌各型肌纤维数目,并计算各型肌纤维百分比的变化。4透射电镜观察透射电镜下观察各组咬肌的肌丝、肌小节、线粒体、肌浆网等结构的改变。第三部分咬合垂直距离升高对大鼠咬肌MHC亚型m RNA表达的影响及MHC亚型转变的机制探讨1实验动物分组及动物模型建立同第一部分2标本留取于实验观察节点7天、14天分别处死不同年龄实验组和对照组大鼠各6只。于大鼠的深层咬肌中央进行取材,预冷生理盐水冲洗血液,液氮速冻, 80℃超低温冰箱冻存。3将所取标本应用real-time PCR技术对咬肌MHC亚型m RNA与生肌调节因子Myo D、myogenin m RNA水平进行相对定量检测。主要步骤包括组织匀浆、Trizol法提取总RNA、RNA完整性检测、引物设计合成、反转录合成c DNA第一链、PCR扩增、??CT法检测咬合垂直距离升高对MHC亚型m RNA及生肌调节因子Myo D、myogenin m RNA水平的影响,并对重链肌球蛋白的m RNA及myogenin:Myo D m RNA水平做相关性分析。结果:第一部分咬合垂直距离升高动物模型的建立1动物的一般情况观察1.1咬合板存留情况观察不同年龄大鼠咬合板在实验期间均有良好的固位,无咬合板脱落的情况发生。1.2动物的行为学观察不同年龄组的大鼠在佩戴咬合板后初期的不适反应经过一周后逐渐改善,至观察期末咬合升高组行为学反应与对照组基本一致。1.3体重变化青少年实验组和年轻成年实验组分别与对照组相比体重无明显统计学差异,P0.05。说明咬合升高未明显影响大鼠营养的摄入和体重增长。2牙牙合变化口外观,后牙被动咬合时青少年大鼠及年轻成年大鼠的上切牙均覆盖下切牙唇面约2mm。在咬合升高后14天的观察期内,青少年大鼠较年轻成年大鼠更快的恢复至咬合升高前前牙咬合状态。口内观可见两组不同年龄大鼠咬牙合板在实验期间均有良好的固位和口腔卫生状况。随时间的增加,咬合板牙合面未见明显不均匀磨耗现象。3头颅侧位片的观察咬合垂直距离升高后,在观察期内不同年龄大鼠的实验组的咬合垂直距离均大于对照组的VT值,具有统计学意义(P0.05);实验组及对照组VT间距的差值在不同年龄组间及在同一年龄组内随时间变化无明显差别(P0.05)。说明实验动物的咬合升高成功,且两组的咬合升高程度较一致,观察期内随时间变化一致,模型可以用作后续实验研究。4 HE染色观察青少年大鼠及年轻成年组大鼠对照组及实验组咬肌纤维的形态、排列、细胞核的形态以及组织间质均未见异常,不同年龄组间无明显差异。第二部分咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠深层咬肌组织形态结构的1组织化学分析结果ATPase染色证明深层咬肌的肌纤维型仅包括MHCⅡ型纤维NADH-TR染色将MHCⅡ型纤维进一步分为三种亚型:深蓝紫色的MHCⅡa型,浅蓝紫色的MHCⅡb型及介于二者之间的MHCⅡx型纤维。青少年大鼠的深层咬肌主要由MHCⅡb型纤维构成,其次为MHCⅡa及MHCⅡx。随观察时间的延长,青少年对照组大鼠的深层咬肌的MHCⅡa减少而MHCⅡb增多,且变化具有统计学意义。当对青少年大鼠给予咬合升高刺激时,咬合升高7天时,对照组MHCⅡa纤维的比例为25.24±2.70%,而实验组的MHCⅡa的比例为45.50±1.89%,即实验组较同期对照组MHCⅡa所增高;而MHCⅡb及MHCⅡx的比例有所下降。当咬合升高14天时,MHCⅡa的纤维比例又有一定的下降,MHCⅡb的纤维比例随之上升。青少年对照组及实验组大鼠的MHCⅡa的纤维比例均大于年轻成年组MHCⅡa的纤维比例。年轻成年组大鼠的深层咬肌也主要由MHCⅡb型纤维构成,其次为MHCⅡx及MHCⅡa。随观察时间的延长,对照组MHCⅡ各型纤维之间的比例变化不明显。当对年轻成年组大鼠给予咬合升高刺激时,咬合升高7天时,对照组与实验组的MHCⅡa及MHCⅡb纤维比例的变化无统计学意义,当咬合升高14天时,MHCⅡa的纤维才开始上升,MHCⅡb的纤维比例随之下降。2透射电镜观察结果咬合垂直距离升高对咬肌肌丝排列及线粒体结构均产生影响。青少年大鼠较年轻成年组大鼠在咬合升高后肌丝改建速度以及线粒体代偿性数目增多、体积增大的现象出现的更早,而其他细胞器也较少出现的损伤性反应。第三部分咬合垂直距离升高对大鼠咬肌MHC亚型m RNA表达的影响及MHC亚型转变的机制探讨1咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠咬肌MHC亚型m RNA表达的影响1.1年龄对重链肌球蛋白m RNA相对表达量的影响青少年对照组的MHCⅡa m RNA表达量高于年轻成年对照组,而MHCⅡb m RNA表达量低于年轻对照组,MHCⅡx m RNA在两组间无统计学差异。1.2咬合垂直距离升高对重链肌球蛋白m RNA相对表达量的影响咬合升高使青少年大鼠及年轻成年组大鼠的MHCⅡa m RNA相对表达量增加,MHCⅡb m RNA及MHCⅡx m RNA相对表达量降低;而年轻成年实验组大鼠MHCⅡa m RNA及MHCⅡb m RNA变化的时间较晚。青少年实验组较年轻成年实验组有更高的MHCⅡa m RNA水平,且MHCⅡb m RNA相对表达量较低。1.3时间变化对重链肌球蛋白m RNA相对表达量的影响青少年对照组大鼠的MHCⅡa m RNA相对表达量随观察时间的延长有逐渐减小的趋势,MHCⅡb m RNA及MHCⅡx m RNA含量逐渐增加。而年轻成年对照组大鼠的MHCⅡa m RNA、MHCⅡb m RNA及MHCⅡx m RNA相对表达量随观察时间的延长无明显变化。青少年实验组大鼠的MHCⅡa m RNA相对含量随观察时间的延长有逐渐减小的趋势,MHCⅡb m RNA含量有增加趋势;年轻成年实验组大鼠的MHCⅡa m RNA相对含量随观察时间的延长增加,MHCⅡb m RNA含量随观察时间的延长降低,晚于青少年实验组大鼠向慢收缩MHC异构型m RNA转化的时间。2咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠咬肌Myo D、myogenin m RNA相对表达量的影响2.1年龄对Myo D、myogenin m RNA相对表达量的影响实验观察期内,青少年大鼠对照组及实验组的Myo D、myogenin m RNA相对表达量均高于年轻成年大鼠的Myo D、myogenin m RNA相对表达量(P0.05)。2.2咬合垂直距离升高对Myo D、myogenin m RNA相对表达量的影响当对青少年实验组大鼠及年轻成年实验组大鼠分别进行咬合升高时,两组Myo D、myogenin m RNA的表达量都有所增加。2.3时间对Myo D、myogenin m RNA相对表达量的影响除年轻成年组大鼠对照组的myogenin m RNA在14天观察期内无明显变化外,青少年大鼠实验组及对照组以及年轻成年组大鼠实验组的Myo D、myogenin m RNA相对表达量随时间增加相对含量降低(P0.05)。3咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠myogenin:Myo D m RNA比值的影响3.1年龄对myogenin:Myo D m RNA比值的影响实验观察期间青少年对照组及实验组的myogenin:Myo D m RNA比值均高于年轻成年对照组及实验组。3.2咬合垂直距离升高对myogenin:Myo D m RNA比值的影响咬合垂直距离升高使不同年龄组大鼠咬肌的myogenin:Myo D m RNA比值上升,年轻成年组上述比值升高晚于青少年组。3.3时间对myogenin:Myo D m RNA比值的影响随观察时间的延长,青少年对照组myogenin:Myo D m RNA比值有所下降,而年轻成年实验组的myogenin:Myo D m RNA比值有所增高。4 myogenin:Myo D m RNA比值与重链肌球蛋白各亚型m RNA表达水平的相关性分析咬合垂直距离升高可使青少年及年轻成年大鼠深层咬肌的Myo D及myogenin m RNA水平都有所增加,而myogenin m RNA较Myo D m RNA升高的更多。myogenin:Myo D m RNA这一比值与MHCⅡa m RNA存在正相关关系,r=0.954;与MHCⅡb m RNA之间存在负相关关系,r=-0.755。结论：1通过双侧磨牙牙合面直接堆塑树脂建立咬合垂直距离升高动物模型具有良好的可操作性及稳定性。2咬合垂直距离升高可使青少年大鼠及年轻成年大鼠的深层咬肌的组织形态结构、重链肌球蛋白m RNA均向较慢收缩类型发生适应性转化。3咬合垂直距离升高使青少年大鼠的深层咬肌发生肌纤维由快收缩型向慢收缩型转化的时间较年轻成年大鼠更早、程度更高,提示在正畸临床中于青少年时期进行深覆牙合的矫治其咬合垂直距离更稳定。同时也说明对年轻成年患者进行咬合升高治疗需足够的时间并在治疗后需要进行长期的保持。4生肌调节因子Myo D和myogenin在纤维类型转变中发挥着一定的作用。
【关键词】：咬合垂直距离升高 深层咬肌 重链肌球蛋白 MyoD myogenin
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R782
，

本文编号：761069