变形链球菌及其耐氟菌株耐酸基因hrcA的测序及甲基化水平分析

发布时间：2017-09-01 16:32

  本文关键词：变形链球菌及其耐氟菌株耐酸基因hrcA的测序及甲基化水平分析

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【摘要】：目的:龋病(dental caries)是在以细菌为主的多种因素作用下,牙体硬组织,发生慢性进行性破坏性的一种疾病。变形链球菌(S.mutans)是目前公认致龋的主要致病菌[6-9],其致龋性主要取决于其产酸性和耐酸性[10]。近些年,氟化物已广泛应用于临床防龋,但长期大量使用氟化物可能会导致耐氟菌株的产生。研究证实S.mutans耐氟菌株的产酸、耐酸的能力均强于亲代菌株,导致了耐氟菌株致龋性增强[48]。DNA甲基化是一种常见的表观遗传学现象,是指在DNA甲基转移酶的催化下,利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基,将特异位点甲基化,是不改变DNA序列的可遗传的基因修饰作用。它参与调控基因表达、基因印记、转座子沉默、胚胎发育、X染色体失活以及癌症发生等重要生物学过程。DNA甲基化能够引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而调控基因的表达[49]。研究表明在细菌中DNA甲基化在调节与毒力有关的功能方面起到一个很重要的角色[2]。目前,学者对变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因fhs、ffh、dgk、dltc、ccpA、dltC、comD[5-7]等都已进行了基因突变位点的检测。但是耐酸相关基因hrcA是否突变还不可知。迄今为止,国内外的研究仅限于对S.mutans耐氟菌株基因水平的检测,而对于基因表观遗传学修饰,尤其是DNA甲基化的研究仍是空白,需要大量探索。因此本实验旨在基因水平上对S.mutans耐氟菌株耐酸相关基因hrc A进行结构基因突变的检测,明确hrcA结构基因是否发生突变。又采用MiSeq亚硫酸氢盐修饰高通量二代测序法对耐酸相关基因hrcA进行甲基化测序,确定耐氟菌株与其亲代菌株甲基化水平是否一致。我们希望通过对S.mutans耐氟菌株耐酸相关基因hrcA基因测序和甲基化水平的分析,更深刻的揭示耐酸性增强的机制,也为龋病的防治提供新的思路和理论指导。方法:1.S.mutans及其耐氟菌株的复苏、培养与鉴定。2.S.mutans全基因组的提取。3.目的基因hrcA的PCR扩增及纯化。4.构建重组质粒:目的基因hrcA的PCR产物与PMD-18T载体连接,转化入E.coli感受态细胞(DH5α)中。5.重组质粒的提取、鉴定及测序6.目的基因hrcA甲基化水平的检测结果:1.经16SrDNA鉴定证实实验培养的细菌为S.mutans耐氟菌株(UA159-FR)。2.成功构建重组质粒。3.重复测序三次,将测序结果与Genbank上公布的S.mutans UA159的基因进行BLAST比对,发现目的基因hrcA的结构基因序列无突变。4.S.mutans耐氟菌株与其亲代菌株的目的基因hrcA甲基化水平检测无显著差异。结论:成功构建了S.mutans耐氟菌株耐酸相关基因hrcA重组质粒,鉴定后进行基因测序,发现hrcA的结构基因序列无突变,并且S.mutans与其耐氟菌株的耐酸相关基因hrcA甲基化水平检测无显著差异。表明耐氟菌株的致龋性增强与耐酸相关基因hrcA的突变和甲基化无明显关系。耐氟菌株致龋性增强的具体原因和机制还需要进一步研究。
【关键词】：S.mutans耐氟菌株 耐酸相关基因 hrcA 基因突变 甲基化
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781.1
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文缩略词表12-13
• 第1章 引言13-15
• 第2章 文献回顾15-19
• 2.1 龋病及变形链球菌耐氟菌株的概述15
• 2.2 S.mutans耐氟菌株的鉴定15-16
• 2.3 S.mutans耐氟菌株耐酸相关基因hrcA的研究意义16-17
• 2.4 DNA甲基化的研究进展17
• 2.5 DNA甲基化的检测方法17-19
• 第3章 实验19-31
• 3.1 材料19-21
• 3.1.1 细菌19
• 3.1.2 仪器19
• 3.1.3 培养基与试剂盒19-20
• 3.1.4 常用培养基的配制20-21
• 3.2 实验方法21-31
• 3.2.1 变形链球菌（UA159）及其耐氟菌株（UA159-FR）的复苏和培养21
• 3.2.2 变形链球菌（UA159）及其耐氟菌株（UA159-FR）的鉴定21-24
• 3.2.3 目的基因引物的设计与合成24-25
• 3.2.4 PCR扩增25
• 3.2.5 琼脂糖凝胶电泳（AGE）鉴定PCR产物25
• 3.2.6 PCR产物回收25
• 3.2.7 琼脂糖凝胶电泳（AGE）鉴定回收后PCR产物25-26
• 3.2.8 PCR产物的酶切26
• 3.2.9 酶切后PCR产物的纯化26-27
• 3.2.10 连接27
• 3.2.11 转化27
• 3.2.12 接种到LB液体培养基27
• 3.2.13 提取重组质粒27-28
• 3.2.14 鉴定重组质粒28-29
• 3.2.15 hrcA甲基化水平检测29-31
• 第4章 结果31-42
• 4.1 S.mutans UA159及其耐氟菌株UA159-FR的复苏和培养31
• 4.2 S.mutans UA159及其耐氟菌株UA159-FR的鉴定31-32
• 4.3 目的基因hrcA的PCR产物及鉴定32
• 4.4 PCR纯化产物的鉴定32-33
• 4.5 感受态细胞（E.coli DH5α）的培养33
• 4.6 重组质粒的鉴定33-34
• 4.7 重组质粒酶切产物的鉴定34
• 4.8 目的基因hrcA的测序结果34-39
• 4.9 hrcA甲基化水平检测结果39-42
• 4.9.1 甲基化碱基覆盖深度39-40
• 4.9.2 甲基化测序位点偏向性40-41
• 4.9.3 甲基化差异性分析41-42
• 第5章 讨论42-44
• 第6章 结论44-45
• 参考文献45-50
• 导师简介50-51
• 作者简介51-52
• 致谢52

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本文编号：773184