前列腺素E2受体EPs在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及意义

发布时间：2017-09-03 08:14

  本文关键词：前列腺素E2受体EPs在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及意义

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【摘要】：口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma, OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,流行病学调查表明其发病年龄趋于年轻化,己成为威胁人类健康的重要疾病之一。目前对于早期OSCC患者,主要采用手术治疗,而对于中晚期OSCC患者,主要采用以手术治疗为主,放射治疗及化学治疗为辅的综合序列治疗。虽然对OSCC的研究逐渐深入,并探索许多预防及治疗OSCC的手段,但由于口腔颌面部血运及淋巴引流丰富,口腔鳞状细胞癌易发生早期淋巴结转移且五年复发率高,中晚期OSCC的治疗效果及预后仍不满意,特别是复发及转移的机制仍不十分清楚,有待我们进一步深入研究。花生四烯酸为二十碳多不饱和脂肪酸,属Omega6族长链多元不饱和脂肪酸。其中含有四个碳.碳双键,一个碳.氧双键,为高级不饱和脂肪酸。研究表明,花生四烯酸不仅是富含能量的分子,其亦可以参与一些基因的诱导,在癌症的发生发展过程中发挥了重要作用。花生四烯酸可以经过磷脂酶A2、环氧化酶、脂氧化酶、细胞色素P450的代谢,分别产生溶血磷脂素类、前列腺素类物、白三烯、羟基二十碳五烯酸及环氧二十碳五烯酸,这些产物在生理及病理过程中发挥了重要作用。花生四烯酸的代谢酶及其相应产物协调了炎症反应,调节多种生物学行为,包括细胞增殖、存活、血管生成、入侵及转移等,其亦可以促进癌症的发生发展。目前关于花生四烯酸促肿瘤作用的研究主要集中于花生四烯酸的环氧化酶代谢信号通路。我们及许多学者研究均发现,包括口腔鳞状细胞癌在内的许多恶性肿瘤的发生、发展、转移以及对治疗效果的影响等均与环氧化酶(Cyclooxygenase,COX)及其代谢产物前列腺素E2密切相关,因此其有可能成为恶性肿瘤治疗的重要靶向。COX是花生四烯酸(Arachidonic acid, AA)向前列腺素类物质转化过程中的重要限速酶,目前发现环氧化酶有两个亚型：即COX-1和COX-2。COX-1是一种持续表达于大多数正常组织细胞内的“结构酶”,在多种生理学功能过程中发挥重要作用,例如,促进血小板凝聚、抑制胃酸过量分泌、调节肾小球血流量并可参与分娩过程等。COX-2是一种“诱导型酶”,在绝大多数正常组织内检测不到,但当细胞受到炎症因子,细胞因子,促有丝分裂原,促癌因子等刺激后,便可产生大量的COX-2。研究发现,COX-2在许多恶性肿瘤组织中呈高表达,并且可以促进肿瘤的发生发展,例如,结直肠癌,乳腺癌,肺癌,前列腺癌,头颈部癌及口腔癌等。流行病学调查表明,长期服用阿斯匹林的关节炎病人,其结直肠癌的发生率降低。临床观察证明,吲哚美辛可以诱导乳腺癌及皮肤鳞状细胞癌癌细胞的退化。关于非甾体类抗炎药物抑制肿瘤生长的机制仍不清楚,但可以肯定的是,其可以抑制环氧化酶的活化,进而抑制前列腺素类物质的产生,进而影响肿瘤细胞的增殖、坏死、免疫反应等病理过程。似乎,阿斯匹林等非甾体类抗炎药物是一种非常有前途的治疗癌症的药物。但临床观察同时表明,长期服用阿斯匹林等非甾体类抗炎药物有心血管及胃肠道系统的副作用。这些副作用阻碍了其在临床上的广泛应用。于是人们开始探索COX-2下游信号通路,寻找更加安全有效的分子作用靶点,以期避免抑制COX-2所带来的副作用。COX-2的下游产物中,与癌症发生发展密切相关的是前列腺素E2(PGE2)。PGE2在许多癌症组织中呈现高表达,并可以促进许多恶性肿瘤的发生发展,例如,结直肠癌,前列腺癌,皮肤癌,口腔癌等。研究证明,PGE2可从以下几个方面促进恶性肿瘤的发生与发展：(1)其可促进一些生长因子受体诱导的级联反应；(2)其通过上调Bcl-2分子的表达来抑制癌细胞的凋亡；(3)其与血管生成因子的产生有关,如血管内皮生长因子；(4)其可抑制免疫调节淋巴因子的产生、抑制T细胞和B细胞的增殖,抑制肿瘤坏死因子和天然杀伤细胞的细胞毒性作用,从而抑制局部免疫反应,使得癌细胞能够逃避免疫系统的攻击；(5)其可促进癌细胞的侵袭特性,从而促进癌细胞的侵袭和转移。PGE2主要通过四种EP受体发挥生理学及病理学作用,即EP1,EP2,EP3及EP4。了解EP受体的作用及其相应机制潜在的提供了预防及治疗口腔鳞状细胞癌的分子作用靶点。EP受体属于G蛋白结合受体,具有七次跨膜结构域,每一种EP受体分别与不同的异源性三聚体Gα亚单位相结合。EP2和EP4受体与Gas亚单位相结合,EPl受体与Gq亚单位相结合,而EP3受体与Gi亚单位相结合。四种EP受体与不同的Ga亚单位相结合,导致了四种EP受体所激活的下流信号通路不同,进而导致了其所介导的生物学作用不同。EP受体所活化的信号通路是背景特异性的,很可能依赖PGE2的表达水平、不同EP受体的表达水平以及其他相互作用受体的表达水平。不同的EP受体在同一种类型的癌症中可能发挥不同的作用,而同一种EP受体在不同的癌症中亦可能发挥不同的作用。一般地,通过调节G蛋白的表达,EP1受体的活化可以促进细胞内钙离子的流动。EP2和EP4受体通过活化G蛋白可以活化细胞内腺苷酸环化酶,而EP3受体的活化可以诱导细胞内钙离子的流动或抑制G蛋白的活性进而抑制细胞内腺苷酸环化酶。目前的研究主要集中于鉴定出哪一种EP受体介导了PGE2的肿瘤促进作用和所涉及的信号通路。大量的研究表明EP受体在肿瘤的发生发展过程中扮演了重要角色。例如,在肝细胞癌中,EP1受体的活化可以激活PKC/NF-κB/FoXC2信号通路,促进β1-integrin的表达,进而促进肝癌细胞的转移。在肝细胞癌中,EP2受体的活化可以激活Src/EGFR/Akt/mTOR信号通路,上调Snail蛋白的表达,进而促进肝癌细胞Huh-7细胞的入侵和转移。在乳腺癌中,EP2及EP4受体的活化可以抑制NK细胞的功能,进而促进癌细胞的转移。EP受体的发现使通过抑制PGE2受体的活性从而抑制肿瘤的发生与发展成为可能,同时也可避免因长期使用COX-2抑制剂而产生的胃肠道、心血管系统的并发症。然而,关于EP受体在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及其所介导的病理学作用仍不清楚,因此本实验拟阐明口腔鳞状细胞癌组织中EP受体的表达模式,为研究EP受体在口腔鳞癌发生发展过程中的作用奠定理论基础。第一章RT-PCR方法检测口腔鳞癌组织中EPs受体mRNA的表达目的：检测口腔鳞状细胞癌组织中EP1、EP2、EP3、EP4受体mRNA的表达。方法：收集2013年5月至2015年5月在南方医院口腔颌面外科行手术治疗的口腔鳞状细胞癌病例40例,所有患者术前均未进行过化学治疗、放射治疗或其他治疗,且无癌症家族史或其他并发症。所有病例均经术后常规HE染色证实为口腔鳞状细胞癌。获取40例口腔鳞癌标本及相应40例癌旁组织标本(距离鳞癌组织约2 cm,且术中切缘冰冻病理检查证实为癌细胞阴性)。将标本保存于RNA-later溶液中,并迅速置于液氮中保存。实验分为两组：(1)实验组：40例口腔鳞癌组织(2)对照组：40例癌旁组织。对EPs受体的表达进行Real-time PCR检测。设定癌旁组织中EPs受体mRNA的表达量为“1”,采用2-△△Ct方法检测口腔鳞癌组织中EPs受体mRNA的表达。所有实验均重复三次。β-actin作为内参照。结果：实时定量PCR结果提示,与癌旁组织相比,鳞癌组织中EP1、EP2受体mRNA的表达量明显升高,EP1、EP2受体mRNA的相对平均表达量分别为1.442±0.4245、1.207±0.4259,经配对t检验,P值均0.05,差异均有统计学意义；与癌旁组织相比,EP3受体mRNA在口腔鳞癌组织中的表达明显降低,相对平均表达量为0.4455±0.3292,经配对t检验,P0.05,差异有统计学意义：与癌旁组织相比,EP4受体mRNA的表达在口腔鳞癌组织中的表达升高,相对平均表达量为1.147±0.4965,经配对t检验,P0.05,差异无统计学意义。结论：EP1、EP2受体mRNA的表达显著上调,EP3受体mRNA的表达显著下调,EPs受体mRNA在口腔鳞状细胞癌组织中的异常表达,可能在口腔鳞状细胞癌的发生发展过程中扮演了重要角色。第二章 免疫组织化学染色方法检测口腔鳞癌组织中EPs受体蛋白的表达目的：检测口腔鳞状细胞癌组织中EP1、EP2、EP3、EP4受体蛋白的表达。方法：收集2013年5月至2015年5月在南方医院口腔颌面外科行手术治疗的口腔鳞状细胞癌病例40例,所有患者术前均未进行过化学治疗、放射治疗或其他治疗,且无癌症家族史或其他并发症。所有病例均经术后常规HE染色证实为口腔鳞状细胞癌。获取40例口腔鳞癌标本及相应40例癌旁组织标本(距离鳞癌组织约2 cm,且术中切缘冰冻病理检查证实为癌细胞阴性)。标本获取后立即放于福尔马林溶液中常温保存。实验分为两组：(1)实验组：40例口腔鳞癌组织(2)对照组：40例癌旁组织。对EPs受体蛋白的表达进行免疫组织化学染色。PBS溶液代替一抗作为阴性对照,己知阳性切片作为阳性对照。使用染色强度和阳性细胞数对染色结果进行半定量。结果：EP1受体在大部分癌旁组织中呈弱阳性表达,而在大部分口腔鳞癌组织中呈中等阳性表达,经Wilcoxon符号秩和检验,T=55,P0.05,差异有统计学意义,口腔鳞癌组织中EP1受体蛋白的表达明显升高。EP2受体在大部分癌旁组织中呈弱阳性表达,而在大部分口腔鳞癌组织中呈中等阳性表达,经Wilcoxon符号秩和检验,T=91,P0.05,差异有统计学意义,口腔鳞癌组织中EP2受体蛋白的表达明显升高。EP3受体在大部分癌旁组织中呈中等阳性表达,而在大部分口腔鳞癌组织中呈弱阳性表达,经Wilcoxon符号秩和检验,T=-114,P0.05,差异有统计学意义,口腔鳞癌组织中EP3受体蛋白的表达明显降低。EP4受体蛋白在大部分癌旁组织及口腔鳞癌组织中均呈中等阳性表达,经Wilcoxon符号秩和检验,T=14,P0.05,差异无统计学意义。结论：EP1、EP2受体蛋白的表达显著上调,EP3受体蛋白的表达显著下调,EPs受体蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中的异常表达,可能在口腔鳞状细胞癌的发生发展过程中扮演了重要角色。第三章 酶联免疫吸附实验测定口腔鳞癌组织中花生四烯酸的表达目的：检测口腔鳞状细胞癌组织中花生四烯酸的表达。方法：收集2013年5月至2015年5月在南方医院口腔颌面外科行手术治疗的口腔鳞状细胞癌病例40例,所有患者术前均未进行过化学治疗、放射治疗或其他治疗,且无癌症家族史或其他并发症。所有病例均经术后常规HE染色证实为口腔鳞状细胞癌。获取40例口腔鳞癌标本及相应的40例癌旁组织标本(距离鳞癌组织约2 cm,且术中切缘冰冻病理检查证实为癌细胞阴性)。标本获取后立即存放于-80度冰箱备用。实验分为两组：(1)实验组：40例口腔鳞癌组织(2)对照组：40例癌旁组织。对花生四烯酸的表达进行酶联免疫吸附实验。结果：与癌旁组织相比,花生四烯酸在口腔鳞状细胞癌组织中的表达明显升高,40例口腔鳞癌组织中花生四烯酸的平均质量分数为477.44-39.84 pg儋,40例癌旁组织中花生四烯酸的平均质量分数为38.44-4.92 pg儋,经配对t检验,P0.05,差异有统计学意义。结论：花生四烯酸在口腔鳞癌组织中的表达显著上调,说明该条信号通路在口腔鳞癌发生发展过程中可能扮演了重要角色。总之,与癌旁组织相比,EP1、EP2受体在口腔鳞癌组织中表达升高,EP3受体在口腔鳞癌组织中表达降低,花生四烯酸在口腔鳞癌组织中表达显著上调,EP受体的异常表达及花生四烯酸的高表达可能与口腔鳞状细胞癌的发生、发展密切相关。
【关键词】：口腔鳞状细胞癌 花生四烯酸 环氧化酶2 EP受体 表达谱
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.85
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-24
• 第一章 RT-PCR方法检测口腔鳞癌组织中EP受体mRNA的表达24-36
• 1 材料与方法24-29
• 2 结果29-32
• 3 讨论32-36
• 第二章 免疫组织化学染色方法检测口腔鳞癌组织中EP受体蛋白的表达36-48
• 1 材料与方法36-41
• 2 结果41-44
• 3 讨论44-48
• 第三章 酶联免疫吸附实验测定口腔鳞癌组织中花生四烯酸的表达48-56
• 1 材料与方法48-51
• 2 结果51-52
• 3 讨论52-56
• 全文总结56-57
• 参考文献57-65
• 中英文对照缩略词表65-66
• 硕士学位期间成果66-67
• 致谢67-69

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