非损伤微测技术用于口腔鳞癌细胞凋亡机制研究的实验探索

发布时间：2017-09-06 16:21

  本文关键词：非损伤微测技术用于口腔鳞癌细胞凋亡机制研究的实验探索

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【摘要】：目的：非损伤微测技术(Non-invasive micro-test technique,NMT)是一种选择性微电极技术,可以在不损伤活体样品的情况下获得进出样品的各种离子或分子的多维信息,能够实时选择性测定进出活体材料离子和小分子流速,该技术具有非损伤性、长时间、多电极、高分辨率、高灵敏度、多角度测量等优点,可在不接触细胞、不干扰细胞活动、不影响细胞内、外环境稳态和调节机制的条件下,获得其他技术难以测到的生理特征和生命活动规律,从而在理论研究和应用领域产生实质性的突破,对活体材料进行实时、动态的测定和研究。将现用于植物生理学研究的非损伤微测技术用于人体细胞生理学研究。应用非损伤微测技术,在不接触细胞、不干扰细胞活动、不影响细胞内、外环境稳态和调节机制的条件下,实时测定进出单个口腔鳞癌细胞的离子和小分子流速,获得肿瘤细胞凋亡时的02和Ca2+流的跨膜变化的动态信息；应用非损伤微测技术了解孟加拉红在光动力干预下与口腔鳞癌细胞相互作用时O2和Ca2+流的跨膜特征,以对孟加拉红在口腔癌诊疗机制有所了解,有助于对其应用前景进行评估。并为探索非损伤微测技术在医学细胞生物学中的进一步应用打下基础。方法：1.非损伤微测技术实时动态观察和记录单个活的口腔鳞癌细胞Ca127的O2和Ca2+的跨膜流动。2.MTT法检测不同浓度的孟加拉红对口腔鳞癌细胞Ca127的细胞毒性,不同浓度的孟加拉红介导的光动力干预下对口腔鳞癌细胞Ca127的细胞毒性；以及检测了相同浓度相同激发光源的条件下,孟加拉红(10μM)介导的光动力干预下对口腔鳞癌细胞Ca127细胞增殖的抑制作用。3.非损伤微测技术实时动态检测孟加拉红介导光动力干预下诱导的单个口腔鳞癌细胞凋亡时的O2和Ca2+流速变化,以及响应光动力疗法诱导的口腔鳞癌细胞凋亡信号通路的研究。(1)荧光探针DCFH-DA检测孟加拉红介导的光动力疗法激发的细胞活性氧(ROS)的生成。(2)荧光探针罗丹明123检测孟加拉红介导光动力疗法诱导的细胞线粒体膜电位(MMP)的变化。(3)Annexin V-FITC/PI双染检测孟加拉红介导的光动力疗法诱导的细胞凋亡率。(4)蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测孟加拉红介导光动力疗法诱导细胞内细胞色素C、Caspase-3、Caspase-9、PARP蛋白的表达水平。(5)非损伤微测技术检测孟加拉红介导光动力疗法诱导的单个口腔鳞癌细胞凋亡时的02和Ca2+跨膜流动的实时动态变化。结果：1.非损伤微测技术实时动态检测了单个口腔鳞癌细胞Ca127的O2和Ca2+的跨膜流动,结果表明Cal27细胞中02在24小时实验观察期内均为内流跨膜移动,分子流的移动速率在16.26 pmole/cm2.s -23.99 pmole/cm2.s之间波动；但Ca2+的跨膜转运动力学特征则表现不同,离子流方向有波动,既有向内又有向外的跨膜移动,外流最大移动速率为5.84 pmole/cm2.s,内流最大移动速率为3.22pmole/cm2.S。2.实验结果显示孟加拉红能够被口腔鳞癌细胞Ca127摄取,进入细胞核和细胞质；低浓度的孟加拉红对口腔鳞癌细胞Ca127没有细胞毒性；但低浓度的孟加拉红介导光动力疗法对口腔鳞癌细胞Ca127有显著的细胞毒性,并且对细胞的增值有明显的抑制作用。3.孟加拉红介导光动力疗法导致口腔鳞癌细胞Ca127细胞内释放大量活性氧,细胞ROS水平显著增加比未处理组高出2.46倍；细胞内产生的ROS水平在RB-PDT处理后2小时显示为最高峰,比未处理组高出2.84倍；ROS的释放导致细胞内线粒体膜电位降低,24小时观察期结束时仅为39.21%；同时,诱导口腔鳞癌细胞凋亡,凋亡持续发生,在RB-PDT处理后2小时,凋亡率出现一个小高峰,达到18.55%：之后逐渐增加,在RB-PDT处理后24小时,达到了30.57%。Western blotting检测结果显示,细胞内细胞色素C在光动力激发后立即释放出现蛋白表达,Caspase-3、Caspase-9、PARP在观察期2小时均开始出现蛋白高水平表达。4.非损伤微测技术实时动态检测到孟加拉红介导光动力疗法诱导的单个口腔鳞癌细胞Ca127凋亡时的02和Ca2+跨膜流速变化,02流在实时动态检测的早期(实验观察期的0-2小时)与未处理组、纯RB和PDT+NAC处理组的细胞相比较,其分子内流移动速率降低,2小时观察时间点的02流移动速率(6.43pmole/cm2.s)是最小值,后期O2分子内流移动速率加大；而Ca2+离子流无论是内流还是外流,移动速率都明显高于未处理组和、纯RB和PDT+NAC处理组,2小时观察时间点的Ca2+离子移动速率(9.53 pmole/cm.s)是Ca2+离子流由外流转变为内流的高峰值。这一结果与上述Annexin V-FITC/PI双染检测的细胞凋亡率和蛋白质免疫印迹法检测的蛋白表达的实验结果所表达的凋亡时间趋势是相一致的；2小时是一个关键和值得关注的观察时间点。结论：1.非损伤微测技术可以用于人体细胞生理学研究,是在不接触细胞、不干扰细胞活动、不影响细胞内、外环境稳态和调节机制的条件下研究细胞病理生理学的一种好的方法,在对细胞生理特征和生命活动规律的研究方面有很大的应用前景。2.成功检测到Ca127细胞在正常生长代谢过程中O2、Ca2+的跨膜转运动力学特征,为后续研究打下基础。3.发现孟加拉红在光动力干预下诱导口腔鳞癌细胞凋亡的机制中：内活性氧大量释放、破坏线粒体细胞膜,线粒体膜电位降低,并造成细胞损伤,细胞色素C释放,激活Caspase级联反应；细胞内细胞色素C、Caspase-3、Caspase-9、PARP蛋白均相续出现高表达。通过上述发现,推测O2和Ca2+流的变化响应了光动力作用后通过线粒体依赖性途径诱导细胞凋亡的信号,可以作为检测肿瘤细胞凋亡信号的指标；
【关键词】：非损伤微测技术 O_2流 Ca~(2+)流 孟加拉红 光动力疗法 细胞凋亡
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.8
【目录】：

• 论文创新点6-7
• 缩略词表7-9
• 中文摘要9-12
• Abstract12-16
• 文献综述(一)16-23
• 文献综述(二)23-29
• 引言29-31
• 实验研究31-80
• 第一部分 非损伤微测技术实时动态检测口腔鳞癌细胞的O_2和Ca~(2+)流的实验研究31-44
• 1 材料32-33
• 2 实验方法和步骤33-37
• 3 结果37-38
• 4 讨论38-39
• 5 附图39-44
• 第二部分 孟加拉红介导光动力疗法抑制口腔鳞癌细胞增值的实验研究44-55
• 1 材料44-45
• 2 实验方法及步骤45-48
• 3 结果48-49
• 4 讨论49-50
• 5 附图50-55
• 第三部分 O_2和Ca~(2+)流的变化响应光动力疗法诱导的口腔鳞癌细胞凋亡信号的55-80
• 1 材料56-57
• 2 实验方法及步骤57-64
• 3 结果64-66
• 4 讨论66-71
• 5 附图71-80
• 参考文献80-89
• 发表的研究相关论文89-90
• 附件90-92
• 致谢92-93

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本文编号：804165