静态牵张力作用下健康和牙周病微环境来源PDLSCs生物学功能及LncRNA表达谱的研究

发布时间：2017-09-08 16:01

  本文关键词：静态牵张力作用下健康和牙周病微环境来源PDLSCs生物学功能及LncRNA表达谱的研究

  更多相关文章： 牙周病微环境 正畸 牵张力 牙周膜干细胞 长链非编码RNA

【摘要】：正畸治疗可以通过移动牙齿改善患者的外貌和笑容,在我国越来越多的成人患者开始寻求完善的正畸治疗,但牙周病高发病率是成人正畸中无法忽视的问题。牙周病发病的主要临床表现是慢性炎症导致的牙周组织丧失、牙齿松动脱落,目前对牙周病的治疗主要包括炎症控制和牙周组织再生等方法。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)因其高增殖分化能力和组织同源性被看作牙周再生中最重要的种子细胞之一。正畸牙齿移动时,PDLSCs可以对力学刺激产生应答,在牙周组织改建中发挥了重要的调控作用。研究表明,牙周炎微环境下PDLSCs的再生能力会受到损害,但其对力的反应是否出现异常尚未可知。Lnc RNA已被证实在炎症性疾病的发生发展中具有重要的调控作用,同时已有研究显示健康牙周组织和牙周病牙周组织中存在大量差异表达的Lnc RNA,但Lnc RNA是否调控健康牙周组织来源的PDLSCs(PDLSCs obtained from healthy periodontal tissues,HPDLSCs)和牙周病组织来源的PDLSCs(PDLSCs obtained from periodontal tissues of periodontitis patients,PPDLSCs)对静态牵张力(Static mechanical strain,SMS)的反应还有待研究。因此针对上述问题,本课题进行了两部分研究:第一部分HPDLSCs和PPDLSCs对不同级别SMS的反应及最佳力值筛选研究目的1.分离培养HPDLSCs和PPDLSCs并鉴定其生物学特性2.明确不同级别SMS对HPDLSCs和PPDLSCs增殖及成骨能力的影响3.明确不同级别SMS对HPDLSCs和PPDLSCs破骨能力及炎症反应的影响4.寻找促进HPDLSCs和PPDLSCs再生能力的最佳SMS力值研究方法1.采用低密度接种法分离培养HPDLSCs和PPDLSCs,流式细胞仪检测细胞表面间充质干细胞标记物的表达,克隆形成能力检测细胞增殖活性,茜素红染色检测细胞成骨能力;2.使用Flexcell Tension Unit对HPDLSCs和PPDLSCs进行6%、8%、10%、12%、14%的SMS加载;3.在不同级别SMS加载后,使用流式细胞仪检测HPDLSCs和PPDLSCs的细胞周期,MTT检测HPDLSCs和PPDLSCs的细胞活性,ALP染色、ALP活性检测、茜素红染色、实时定量RT-PCR检测HPDLSCs和PPDLSCs的成骨能力;4.在不同级别SMS加载后,实时定量RT-PCR检测HPDLSCs和PPDLSCs中破骨基因Rankl和C-fos的表达,Elisa检测HPDLSCs和PPDLSCs中炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的分泌情况。实验结果1.HPDLSCs和PPDLSCs均强阳性表达间充质干细胞表面标记物Stro-1、CD146、CD90和CD29,阴性表达造血系标记物CD31和CD14,同时,Stro-1、CD146、CD90和CD29在HPDLSCs中的表达比率均显著高于在PPDLSCs。克隆形成能力检测显示HPDLSCs的克隆形成率为37%,PPDLSCs的克隆形成率为64%。茜素红染色结果证实HPDLSCs和PPDLSCs均可以形成矿化结节,其中HPDLSCs形成的矿化结节较PPDLSCs多且面积大。2.细胞周期和MTT实验结果显示,在未加力情况下,PPDLSCs的增殖能力明显高于HPDLSCs;而在牵张力加载后,从6%到14%的SMS对HPDLSCs的增殖能力均产生了促进作用,其中12%的力值促进作用最佳;对于PPDLSCs,只有6%和8%的SMS能够促进其增殖,其中8%的力值效果更优;当SMS大于8%时,PPDLSCs的增殖能力随力值增加而显著下降。ALP染色、ALP活性检测、茜素红染色和实时定量RT-PCR结果一致显示,在未加力情况下,PPDLSCs的成骨能力低于HPDLSCs,而在SMS加载后,HPDLSCs中各项成骨指标均显著上调,其中12%SMS对HPDLSCs的成骨作用促进能力最强;而对于PPDLSCs,8%SMS能最大程度促进其成骨能力,当力值大于8%时,会对PPDLSCs的成骨能力产生明显的抑制作用。3.实时定量RT-PCR检测加力组和对照组HPDLSCs及PPDLSCs中Rankl、C-fos的表达,结果显示,在未加力情况下,PPDLSCs中Rankl和C-fos的表达水平明显高于HPDLSCs;而在牵张力加载后,当力值低于12%时,HPDLSCs中Rankl和C-fos的表达水平较未加力时无明显变化;当力值大于12%时,Rankl和C-fos的表达显著上调;在PPDLSCs组,当力值低于8%时,Rankl和C-fos的表达无明显变化,当力值大于8%时,可明显激活两种破骨基因的表达。Elisa检测结果显示,PPDLSCs中IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的表达水平均高于HPDLSCs;在SMS加载后,HPDLSCs和PPDLSCs中IL-1β和TNF-α的表达水平略有升高,但不同力值对炎症因子的表达无明显差异,而在SMS加载后IL-6和IL-8的表达水平发生了大幅上调;在HPDLSCs组,当力值低于12%时,加力组各组间IL-6和IL-8的表达水平无明显差异,但当力值高于12%时,IL-6和IL-8的表达水平显著上升;而在PPDLSCs组,6%和8%的牵张力值对IL-6和IL-8的表达影响基本无区别,但当力值大于8%,IL-6和IL-8的表达会随着力值的增大而逐渐增强。结论1.HPDLSCs和PPDLSCs均表达间充质干细胞标记物,具有自我更新和多向分化潜能;但牙周病微环境刺激了PPDLSCs的增殖能力、损害了其间充质干细胞表达率和成骨能力;2.HPDLSCs和PPDLSCs对SMS的反应不同,炎症微环境使得PPDLSCs的力学敏感性增强,耐受性减弱;过大的静态牵张力会导致PPDLSCs的增殖能力降低,成骨破骨平衡被破坏,炎症反应被激活;3.从促进牙周再生和组织改建的角度,施加于HPDLSCs的最佳SMS力值为12%,PPDLSCs的最佳SMS为8%。第二部分12%SMS作用下HPDLSCs和PPDLSCs中Lnc RNA芯片表达谱研究研究目的1.筛选12%SMS作用下HPDLSCs和PPDLSCs中差异表达的Lnc RNA2.对HPDLSCs和PPDLSCs中Lnc RNA的差异表达情况及功能进行分析研究方法1.12%SMS加载后,TRIzol提取HPDLSCs和PPDLSCs总RNA,RNasey Mini Kit对RNA进行纯化,分光光度计检测对样本RNA进行质检及浓度测定,琼脂糖凝胶电泳检测样本完整性以及是否被g DNA污染,合成并纯化c DNA后Nano Drop ND-1000检测其质量,Nimble Gen Hybridization系统和Nimble Gen wash buffer进行芯片杂交洗涤,Axon Gene Pix 4000B进行芯片扫描,Nimble Scan software和Agilent Gene Spring GX software进行图像数据分析。2.利用KEGG生物学通路分析、GO分析、CNC分析对差异表达的Lnc RNA进行功能分析3.实时定量PCR验证Lnc RNA芯片的可信度实验结果1.分光光度计检测结果显示,HPDLSCs和PPDLSCs样本中提取的RNA吸光度值均在1.8-2.1之间,接近2.0。琼脂糖凝胶电泳检测显示各样本所提取RNA无g DNA污染,无明显降解,可以用于后续芯片实验。箱图结果可见6个细胞样本芯片荧光信号的强度一致,因此不会因信号不一致而导致结果不可靠。散点图、火山图、聚类图直观的显示出HPDLSCs和PPDLSCs在牵张力加载后存在大量差异表达的Lnc RNA。2.在12%SMS加载后变化倍数2且有统计学意义的Lnc RNA在HPDLSCs中有8847种,PPDLSCs中有9772种,在HPDLSCs和PPDLSCs中共同表达的Lnc RNA有7223种;而仅在HPDLSCs加力后发生变化的为1624种,其中表达倍数20倍的为27种(均为上调);仅在PPDLSCs加力后表达发生变化的为2549种,其中表达倍数20倍的为16种(9种上调,7种下调)。3.KEGG生物学通路分析显示在HPDLSCs中差异表达的生物学通路包括脂肪酸降解通路、MAPK信号通路、血管平滑肌收缩通路、脂肪酸代谢通路、淀粉和蔗糖代谢通路、叶酸碳库通路、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路、矿化吸收通路、钙离子信号通路、内质网蛋白加工通路;而在PPDLSCs中差异表达的生物学通路包括鞘脂类代谢通路、可卡因成瘾通路、Erb B信号通路、亨廷顿氏舞蹈病通路、赖氨酸生物合成通路、B细胞受体信号通路、膀胱癌通路、同源重组通路、非小细胞肺癌通路、非酒精脂肪肝疾病通路。GO分析结果显示在HPDLSCs中差异表达的BP(biological process)条目有多个与力学刺激和细胞外信号转导相关,例如response to stress、regulation of response to stimulus等;而在PPDLSCs中这些通路条目没有出现。CNC分析结果显示,差异表达最为显著的10个Lnc RNA能够与相应m RNA形成1250个共表达基因对,对这些共表达的m RNA进行KEGG分析结果显示其主要与arginine and proline mtabolism、cell adhesion molecules和leukocyte transendothelial migration通路有关。4.实时定量RT-PCR显示,随机选取的四种Lnc RNA(TCONS_00008604、ENST00000428781、Uc004arq.1、ENST00000445814)表达情况与芯片结果趋势一致。结论1.本实验收集的RNA样本质检合格,可用于Lnc RNA芯片实验;2.12%SMS加载条件下HPDLSCs和PPDLSCs中存在大量差异表达的Lnc RNA;3.HPDLSCs中差异表达m RNA涉及的生物学通路大都为正常生物学反应通路,而PPDLSCs中差异表达m RNA涉及的生物学通路多数与疾病相关;4.在HPDLSCs中差异表达显著的与力学刺激和细胞外信号传导相关通路在PPDLSCs中未发生明显变化,说明牙周炎微环境可能导致PPDLSCs对力学刺激的反应出现异常;5.实时定量RT-PCR结果显示四种随机选取Lnc RNA的变化趋势同芯片结果一致,其中ENST00000445814差异表达倍数达250倍,可能作为我们下一步的研究目标。
【关键词】：牙周病微环境 正畸 牵张力 牙周膜干细胞 长链非编码RNA
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R783.5
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-13
• 英文摘要13-20
• 前言20-22
• 文献回顾22-33
• 第一部分 HPDLSCS和PPDLSCS对不同级别SMS的反应及最佳力值筛选33-60
• 实验一 HPDLSCS和PPDLSCS的培养、鉴定及SMS加载装置的建立35-45
• 1 材料35-36
• 1.1 主要仪器35
• 1.2 主要试剂35-36
• 2 方法36-39
• 2.1 HPDLSCs和PPDLSCs的细胞来源36
• 2.2 HPDLSCs和PPDLSCs的细胞原代培养及纯化36-37
• 2.3 HPDLSCs和PPDLSCs的生物学特性鉴定37-38
• 2.4 SMS加载装置的构建38
• 2.5 统计学分析38-39
• 3 结果39-43
• 3.1 HPDLSCs及PPDLSCs形态学观察39
• 3.2 HPDLSCs及PPDLSCs表面分子表型鉴定39-40
• 3.3 HPDLSCs及PPDLSCs克隆形成能力鉴定40-41
• 3.4 HPDLSCs及PPDLSCs多向分化能力鉴定41-43
• 3.5 SMS加载装置的构建43
• 4 讨论43-45
• 实验二 不同级别SMS对HPDLSCS和PPDLSCS增殖及成骨能力的影响45-55
• 1 材料45-46
• 1.1 主要仪器45
• 1.2 主要试剂45-46
• 2 方法46-48
• 2.1 HPDLSCs及PPDLSCs的增殖能力检测46
• 2.2 HPDLSCs及PPDLSCs的成骨能力检测46-48
• 2.3 统计学分析48
• 3 结果48-53
• 3.1 不同级别SMS对HPDLSCs和PPDLSCs增殖能力的影响48-50
• 3.2 不同级别SMS对HPDLSCs和PPDLSCs成骨能力的影响50-53
• 4 讨论53-55
• 实验三 不同级别SMS对HPDLSCS和PPDLSCS破骨能力及炎症反应的影响55-60
• 1 材料55
• 1.1 主要试剂55
• 1.2 主要仪器55
• 2 方法55-57
• 2.1 实时定量RT-PCR检测破骨相关基因表达55-56
• 2.2 Elisa检测炎症因子的分泌水平56
• 2.4 统计学分析56-57
• 3 结果57-59
• 3.1 不同级别SMS对HPDLSCs和PPDLSCs破骨基因表达的影响57
• 3.2 不同级别SMS对HPDLSCs和PPDLSCs炎症因子分泌的影响57-59
• 4 讨论59-60
• 第二部分 12%SMS作用下HPDLSCS和PPDLSCS中LNCRNA芯片表达谱研究5560-93
• 实验一 HPDLSCS和PPDLSCS芯片样品的制备、质控检测及基因芯片表达谱构建62-71
• 1 材料62-63
• 1.1 主要仪器62
• 1.2 主要试剂62-63
• 2 方法63-65
• 2.1 HPDLSCs及PPDLSCs的细胞培养及SMS加载63
• 2.2 HPDLSCs及PPDLSCs的总RNA提取63
• 2.3 HPDLSCs及PPDLSCs的RNA纯化63-64
• 2.4 HPDLSCs及PPDLSCs的RNA质检和浓度测定64
• 2.5 HPDLSCs及PPDLSCs总RNA变性琼脂糖凝胶电泳检测64
• 2.6 HPDLSCs及PPDLSCs的cDNA合成64
• 2.7 cDNA的纯化、质检及标记64-65
• 2.8 芯片杂交洗涤及扫描65
• 2.9 数据分析65
• 3 结果65-69
• 3.1 HPDLSCs和PPDLSCs样本RNA的分光光度计检测结果65-66
• 3.2 HPDLSCs和PPDLSCs样本RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果66
• 3.3 HPDLSCs和PPDLSCs样本RNA的箱图结果66-67
• 3.4 HPDLSCs和PPDLSCs样本RNA的散点图结果67
• 3.5 HPDLSCs和PPDLSCs样本RNA的火山图结果67-68
• 3.6 HPDLSCs和PPDLSCs样本RNA的聚类分析及热图结果68-69
• 4 讨论69-71
• 实验二 HPDLSCS和PPDLSCS中LNCRNA的差异表达情况、功能分析及PCR验证71-93
• 1 材料71
• 2 方法71-72
• 2.1 数据分析71
• 2.2 KEGG（the database of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)）生物学通路分析71
• 2.3 GO（the Gene Ontology project）分析71
• 2.4 CNC网络关系图构建及相关基因的功能注释71-72
• 2.5 实时定量RT-PCR72
• 2.6 统计学分析72
• 3 结果72-91
• 3.1 12%SMS加载后HPDLSCs和PPDLSCs中差异表达的LncRNA72-75
• 3.2 12%SMS加载后HPDLSCs和PPDLSCs中差异表达的mRNA75-78
• 3.3 异常表达mRNA的生物信息学预测研究78-90
• 3.4 实时定量RT-PCR验证90-91
• 4 讨论91-93
• 小结93-94
• 参考文献94-104
• 个人简历和研究成果104-106
• 致谢106

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本文编号：814939