Semaphorin 3A的促成骨分化作用在2型糖尿病大鼠种植体骨结合中的应用研究

发布时间：2017-09-11 15:26

  本文关键词：Semaphorin 3A的促成骨分化作用在2型糖尿病大鼠种植体骨结合中的应用研究

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【摘要】：种植义齿是目前最为理想的口腔缺牙修复方式,但由于骨结合不良,T2DM患者种植义齿的失败率显著高于健康缺牙患者。有研究表明T2DM种植体周围成骨相关细胞的成骨分化能力受到抑制是骨结合不足的关键因素,因此,提高成骨相关细胞的成骨分化能力是解决T2DM骨结合不良的根本途径。Sema3A是新发现的极具特色的骨保护因子,能够同时有效的促进成骨分化和抑制破骨分化,可能是较为理想的提高种植体骨结合的分子。因此,本研究首先采用了壳聚糖薄膜作为载体将Sema3A负载到钛种植体表面,体外观察了其促进成骨分化的效应。近些年来,由于ASCs具有来源广泛、取材方便、伤害性小等优势,是极为理想的干细胞来源,而基于ASCs的膜片技术被认为是极富前景的组织修复技术,目前尚未见应用于种植体周围的报道。与此同时,对于ASCs成骨分化能力目前尚存在诸多争议,多数认为ASCs的骨基质矿化作用和钙沉积尚不能满足T2DM患者种植修复的临床需求,因此有必要提高ASCs的成骨能力以应用于种植体周围。因此,本研究随后拟采用Sema3A修饰ASCs,检测Sema3A对于ASCs形态、增殖及成骨能力的影响,并通过动物体内实验证实Sema3A修饰的ASCs膜片包裹到种植体周围对T2DM大鼠种植体骨结合的作用。第一部分Sema3A修饰的种植体表面对成骨细胞成骨分化的促进作用目的:观察Sema3A修饰的种植体表面对成骨细胞行为的影响。方法:钛种植体采用MAO处理,利用硅烷偶联剂将壳聚糖和Sema3A混合物共价结合到MAO钛种植体表面,根据种植体表面加载复合物的不同分为四组:CS/sema-MAO、CS/BSA-MAO、CS-MAO和MAO。将成骨细胞MG63直接接种到不同试样表面,培养2小时后采用DAPI染色观察细胞粘附数量;培养1、3、7天后采用MTT检测细胞活力;成骨诱导3、7天后采用RT-q PCR检测成骨相关基因RUNX2、ALP、OCN、BMP的表达;成骨诱导21天后采用茜素红检测矿化形成。结果:经Sema3A修饰后的MAO种植体对成骨细胞粘附能力与对照组无显著差别;在各个培养时间点对细胞活力无明显影响;诱导3天后RUNX2表达提升3倍以上,其余基因表达提升了2倍以上,诱导7天后RUNX2无显著提升,但其余基因表达提升到3倍以上;茜素红染色显示Sema3A修饰后的种植体能够显著促进成骨细胞矿化能力。结论:Sema3A修饰的种植体表面能够显著提升成骨细胞的成骨分化能力。第二部分Sema3A对ASCs形态、增殖及成骨分化的影响目的:观察Sema3A对ASCs形态、增殖及成骨分化的影响。方法:调整Sema3A在培养液中的终浓度为0、0.25、0.5、1.0μg/ml,对应实验的4个组:ASC组;ASC-0.25组;ASC-0.5组;ASC-1.0组。采用扫描电镜观察细胞形态变化;CCK-8法检测细胞增殖活性;RT-q PCR技术检测成骨相关基因表达的影响;ALP染色、天狼星红染色、茜素红染色观察ALP活性、胶原分泌和矿化程度。结果:(1)Sema3A对于ASCs形态变化无明显影响。(2)Sema3A剂量的改变未对ASCs增殖能力产生影响。(3)随着Sema3A浓度的增加,成骨分化相关基因ALP、COL1等表达明显升高。(4)随着Sema3A浓度的增加,ALP表达和胶原分泌增加;茜素红染色可见Sema3A干预组钙结节生成较空白ASCs组增加,但各个浓度之间差异不明显。结论:Sema3A对于ASCs形态变化、增殖能力均影响不大,但能够显著增强ASCs的成骨分化能力,且Sema3A浓度的增加,促进作用也增强。第三部分Sema3A修饰的ASCs膜片对T2DM大鼠种植体骨结合的作用目的:观察Sema3A修饰后的ASCs膜片对于T2DM种植体骨结合的影响。方法:高脂高糖饲料喂养+小剂量STZ腹腔注射诱导T2DM大鼠,采用含不同浓度Sema3A(0、0.25、0.5、1.0μg/ml)的成膜诱导液培养诱导ASCs形成膜片并包裹种植体形成膜片-种植体复合物,将膜片-种植体复合物植入T2DM大鼠胫骨近骺端,4周、8周后取材分别行Micro-CT扫描及Van Gieson染色分析。结果:诱导成功的T2DM大鼠随机血糖较稳定,且均16.7 mmol/l;倒置光学显微镜下可见膜片诱导成功,刮取后回缩成球形,能很好的包裹种植体;Micro-CT扫描结果可见,随Sema3A浓度的增加,种植体周围新骨形成增加;组织染色可见Sema3A修饰的ASCs膜片组种植体周围可见较厚且连续的新骨生成。结论:Sema3A修饰的ASCs膜片能够促进T2DM种植体骨结合。
【关键词】：2型糖尿病 骨结合 脂肪干细胞 Semaphorins 3A
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1;R783
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文献回顾17-27
• 第一部分Sema3A修饰的种植体表面对成骨细胞成骨分化的促进作用27-35
• 1 实验材料27-28
• 1.1 主要实验试剂与材料27-28
• 1.2 主要实验仪器28
• 2 实验方法28-30
• 2.1 实验分组28-29
• 2.2 Sema3A涂层制备29
• 2.3 细胞粘附观察29
• 2.4 细胞活力检测29
• 2.5 成骨相关基因检测29-30
• 2.6 茜素红染色30
• 2.7 统计分析30
• 3 结果30-33
• 3.1 细胞粘附30-31
• 3.2 细胞活力检测31-32
• 3.3 成骨相关基因表达32-33
• 3.4 矿化染色33
• 4 讨论33-35
• 第二部分Sema3A对于ASCS形态、增殖及成骨能力影响的研究35-45
• 1 实验材料35-36
• 1.1 主要实验试剂与材料35-36
• 1.2 主要实验仪器36
• 1.3 实验动物36
• 2 实验方法36-38
• 2.1 实验分组36
• 2.2 大鼠ASCs的分离培养36-37
• 2.3 含不同浓度Sema3A的培养液对于大鼠ASCs形态变化的影响37
• 2.4 含不同浓度Sema3A的培养液对于大鼠ASCs增殖能力的影响37
• 2.5 不同浓度Sema3A的对于大鼠ASCs成骨基因表达情况的影响37-38
• 2.6 不同浓度Sema3A对于ASCs成骨染色的影响38
• 2.7 统计学分析38
• 3 实验结果38-43
• 3.1 ASCs形态观察38-39
• 3.2 不同浓度Sema3A对于ASCs形态变化的影响39
• 3.3 不同浓度Sema3A对于ASCs增殖能力的影响39-40
• 3.4 不同浓度Sema3A对于大鼠ASCs成骨基因表达情况的影响40-41
• 3.5 不同浓度Sema3A对于大鼠ASCs成骨染色的影响41-43
• 4 讨论43-45
• 第三部分Sema3A修饰ASCS膜片对T2DM种植体骨结合的影响45-55
• 1 实验材料45-47
• 1.1 主要实验试剂与材料45-46
• 1.2 主要实验仪器46
• 1.3 实验动物46-47
• 2 实验方法47-50
• 2.1 实验分组47
• 2.2 T2DM大鼠模型的构建47-48
• 2.3 大鼠ASCs的分离培养及成膜诱导48
• 2.4 将Sema3A修饰的ASCs膜片包裹种植体，，植入T2DM大鼠胫骨48-49
• 2.5 Micro-CT扫描49
• 2.6 组织学染色49-50
• 2.7 统计学分析50
• 3 结果50-53
• 3.1 T2DM大鼠模型的构建50-51
• 3.2 膜片、膜片种植体复合物51-52
• 3.3 Micro-CT扫描及分析52
• 3.4 组织学染色52-53
• 4 讨论53-55
• 小结55-56
• 参考文献56-67
• 个人简历和研究成果67-68
• 致谢68

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