变异链球菌中抗坏血酸特异性磷酸转移酶系统相关基因的初步研究

发布时间：2017-09-12 12:03

  本文关键词：变异链球菌中抗坏血酸特异性磷酸转移酶系统相关基因的初步研究

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【摘要】：研究背景及目的龋病是危害人类口腔健康最常见的疾病,目前较为公认的致龋菌之一是变异链球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)。 S. mutans可通过代谢碳水化合物,从而发挥产酸、耐酸、黏附、合成胞外多糖、形成生物膜等与致龋相关的生物学特性。通过对S. mutans UA159全基因组测序的分析表明,S. mutans有15%的基因与碳水化合物的代谢有关,呈现出强大的碳水化合物代谢能力。S. mutans可以多种方式吸收转运碳水化合物,但最主要、转运效率最高的方式为磷酸烯醇式丙酮酸：磷酸转移酶系统(Phosphoenolpyruvate-dependent:phosphotransferase system, PTS)。PTS一般由三部分组成,分别为酶I(enzyme Ⅰ, EI)、含组氨酸的磷酸载体蛋白(histidine-containing phosphocarrier protein, HPr),以及酶I1(enzyme Ⅱ.ElI)复合体。其中EI和HPr不具有底物特异性,而ElI复合体具有底物特异性,一般由IIA、1IB和IIC三个结构域组成,负责对特定底物的磷酸化及跨膜转运。由于PTS在碳水化合物的转运代谢中发挥着重要作用,关于PTS的研究受到国内外众多学者的关注。目前已有学者针对S. mutans特异性转运葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇的PTS展开研究,但尚未有关于S. mutans抗坏血酸特异性PTS的研究。ptxA基因(NCBI GeneID:1027857)与ptxB基因(NCBI GeneID:1027854)分别编码S. mutans UA159 PTS中抗坏血酸家族EII复合体中的EIIA和EIIB。有学者曾经对PtxA、PtxB蛋白的三维晶体结构进行解析,并进行体外酶活性实验研究,发现这两个蛋白对抗坏血酸的磷酸化具有特异性,并推断PtxA、PtxB蛋白应与S. mutans对抗坏血酸的转运有关。抗坏血酸在自然界中分布广泛,尤其在水果及蔬菜中含量丰富。研究发现,许多细菌均可在无氧条件下发酵抗坏血酸,以获得维持生命活动的碳源,如大肠杆菌、乳酸杆菌、肺炎杆菌等。本课题组前期研究发现,S. mutans亦可在厌氧环境中发酵抗坏血酸,以维持生存。而如果敲除S. mutans的ptxA基因,其抗坏血酸的代谢将出现障碍,ptxA基因缺陷的S. mutans在抗坏血酸特异性培养基中的生长、产酸、形成生物膜能力均受到明显影响。鉴于ptxA基因在S. mutans抗坏血酸代谢中发挥的重要作用,为了探究ptxA基因上游的ptxB基因是否也发挥着类似的作用,并明确它们之间的关系,本研究拟构建ptxB基因缺陷菌株和ptxA、ptxB基因双重缺陷菌株,及其功能补偿菌株,研究上述缺陷菌株和补偿菌株在抗坏血酸特异性培养基中的生长、产酸、耐酸、合成胞外多糖及形成生物膜的能力,明确ptxA、ptxB基因对S. mutans生物学特性的影响。此外,对ptxA、ptxB基因及其邻近基因的转录情况进行分析,以加深对S. mutans抗坏血酸特异性PTS的理解。第一章变异链球菌ptxA、ptxB基因缺陷菌株及其功能补偿菌株的构建目的：构建ptxB基因缺陷菌株和ptxA、ptxB基因双重缺陷菌株,并另外构建ptxA功能补偿菌株、ptxB功能补偿菌株和ptxA、ptxB功能补偿菌株,为后续研究奠定基础。方法：根据S. mutans UA159全基因组的序列,采用Primer Premier 5.0软件设计目的基因的上下游引物,并PCR扩增上下游片段。以pFW5质粒为载体,通过双酶切,将上下游片段插入至质粒的两个多克隆位点中,构建目的基因缺陷的重组质粒。而后,在感受态刺激肽的作用下,将此重组质粒转化入野生型S. mutansUA159中,构建基因缺陷菌株。利用类似方法,以pDL278质粒为载体,构建功能补偿质粒,而后转化入相应的基因缺陷菌株中,构建功能补偿菌株。结果：经过PCR鉴定和测序鉴定,ptxB缺陷菌株(ptxB-)、ptxAB双重基因缺陷菌株(ptxAB-)、ptxA功能补偿菌株(CptxA-)、ptxB功能补偿菌株(CptxB-)和ptxAB功能补偿菌株(CptxAB-)构建成功。第二章变异链球菌ptxA、ptxB基因对其生物学特性的影响目的：研究S.mutans UA159、ptxA-菌株、ptxB-菌株、ptxAB-菌株、CptxA-菌株、CptxB-菌株、CptxAB-菌株在抗坏血酸特异性培养基中的生长、产酸、耐酸、胞外多糖合成及生物膜形成能力,明确ptxA.ptxB基因对S. mutans生物学特性的影响。方法：1.配制抗坏血酸特异性培养基。采用胰蛋白胨-维生素培养基作为基础培养基,添加浓度为15 mmol/L的抗坏血酸,以提供S.mutans生长所需的碳源。2.探究各菌株在抗坏血酸特异性培养基中的生长情况。将S. mutans UA159、 ptxA-菌株、ptxB-菌株、ptxAB-菌株、CptaxA-菌株、CptxB-菌株、CptxAB-菌株分别加入至抗坏血酸特异性培养基中,37℃厌氧培养72 h。期间每隔2 h测量各菌液的OD600值,绘制各菌株的生长曲线。3.探究各菌株在抗坏血酸特异性培养基中的产酸能力。将7种菌株分别加入至抗坏血酸特异性培养基中作为实验组,对照组加入至BHI培养基中,37℃厌氧培养48 h。于培养前、培养24 h后及培养48 h后分别测量各培养基的pH值,计算各菌株培养前后的△pH值。4.探究各菌株在抗坏血酸特异性培养基中的耐酸能力。将7种菌株置于抗坏血酸特异性培养基中,37℃厌氧培养至OD600≈0.3,离心,收集菌胞,加入至pH 5.0的抗坏血酸特异性培养基中,37℃厌氧孵育1 h进行酸适应。而后,采用0.1mol/L,pH 7.0的甘氨酸溶液洗涤,0.1 mol/L,pH 2.8的甘氨酸溶液重悬,并静置0,15,30,45 min,对细菌进行酸冲击。随后,将菌液进行梯度稀释,涂板,37℃厌氧培养48h后观察平板上的菌落数。5.探究各菌株在抗坏血酸特异性培养基中的生物膜形成能力。将7种菌株分别加入至抗坏血酸特异性培养基中,并转移至已放置好无菌盖玻片的六孔板中,37℃厌氧培养120 h。经过洗涤、干燥,使用SYTO9对细菌形成的生物膜进行染色,激光共聚焦显微镜观察,随机选择5个视野进行拍照。使用Image J软件对所有照片进行分析,计算生物膜平均的覆盖面积。6.探究各菌株在抗坏血酸特异性培养基中的胞外多糖合成能力。将7种菌株分别加入至抗坏血酸特异性培养基中,并转移至已放置好无菌盖玻片的六孔板中,37℃厌氧培养120 h。经过洗涤、干燥,使用Calcofluor White对细菌合成的胞外多糖进行染色,激光共聚焦显微镜观察。7.统计学分析。采用SPSS 20.0软件对耐酸实验的结果进行统计学分析。采用单因素方差分析的方法,P0.05代表具有统计学差异。结果：1.与野生型S. mutans UA159相比,缺陷株的生长能力受到明显影响。ptxA缺陷菌株的迟缓期延长,其终末菌密度降低。ptxB缺陷菌株与ptxAB双重基因缺陷菌株在监测的72 h内未见明显增长。ptxA功能补偿菌株和ptxAB功能补偿菌株可在一定程度上补偿缺陷菌株的生长能力,但仍未达到野生株的水平。而ptxB功能补偿菌株无法对缺陷菌株的生长能力进行补偿。2.野生株、缺陷株和补偿株在BHI培养基中的产酸能力相同,而在抗坏血酸特异性培养基中不同。培养24 h后,野生株UA159培养基的pH值轻微下降,而三种缺陷菌株培养基的pH值基本不变,与野生株相比,△pH的差异均具有统计学意义(P0.05)。ptxA、ptxAB功能补偿菌株可在一定程度上补偿缺陷菌株的产酸能力,但ptxB功能补偿菌株却无法对此进行补偿。在培养48 h后,各菌株培养基的pH值进一步下降,且野生株和缺陷株在产酸能力上的差异更加明显,具有统计学意义(P0.01)。3.经过1 h pH 5.0的酸适应和15 min pH 2.8的酸冲击后,三种缺陷菌均无法在琼脂平板上长出。4.经SYT09染色的细菌生物膜呈现绿色。野生株UA159形成的生物膜较为致密,细菌团块较大,遍布整个视野,覆盖面积为65.93%。ptxA基因缺陷菌株所形成的生物膜较野生型稀疏,呈网状结构,存在不规则圆形或椭圆形大小不一的孔隙,覆盖面积仅为39.61%。ptxB、ptxAB基因缺陷菌株无法形成具有三维结构的生物膜,细菌呈短链状排列,散在分布,覆盖面积分别为24.24%和18.57%。ptxA、ptxAB功能补偿菌株形成的生物膜与野生株相似,但孔隙较大,而ptxB功能补偿菌株无法恢复至野生株的水平。5.经Calcofluor White染色的细菌胞外多糖呈现蓝色。各菌株合成胞外多糖的情况与其形成生物膜的情况类似,胞外多糖的分布与生物膜的分布基本一致。ptxA、ptxB、ptxAB基因缺陷菌株所合成的胞外多糖较野生株明显减少。结论：1. S. mutans的ptxA、ptxB基因与抗坏血酸的转运代谢密切相关。2. ptxA、ptxB基因的缺陷可影响S. mutans在抗坏血酸特异性培养基中的生长、产酸、耐酸、胞外多糖合成及生物膜形成能力。第三章变异链球菌ptxA、ptxB基因及其邻近基因转录情况的研究目的：分析S. mutans中ptxA、ptxB基因及其邻近的sgaT、SMU.273、SMU.274、SMU.2乃基因的转录情况,探究在S. mutans中是否存在与抗坏血酸转运代谢相关的操纵子。方法：1.对JptxB基因及其邻近基因进行PCR分析。提取S. mutans的基因组DNA及总RNA,将其逆转录为cDNA。根据S. mutans的全基因组序列,跨越SMU.268与sgaT (a), sgaT与ptxB(b), ptxB与txA (c), ptxA与SMU.273(d),SMU.273与SMU.274(e),SMU.274与SMU.275(D,SMU.2乃与SMU.277(g)设计引物,实验组以cDNA为模版,阳性对照组以基因组DNA为模版进行PCR反应,反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,观察实验组是否出现与阳性对照组大小一致的条带。2. qRT-PCR检测抗坏血酸对S. mutans中ptxA、ptxB基因及其邻近基因表达的影响。将野生型S. mutans分别置于抗坏血酸或葡萄糖特异性培养基中,厌氧培养至对数生长后期,提取总RNA,逆转录为cDNA,以16S rRNA为内参,使用qRT-PCR检测抗坏血酸对ptxA、ptxB基因及其邻近基因表达的影响。3.使用qRT-PCR检测野生型S. mutans及ptxB基因缺陷菌株中ptxA基因的表达情况。4.统计学分析。采用SPSS 20.0软件对qRT-PCR的结果进行统计学分析。采用两独立样本t检验的方法,P0.05代表具有统计学差异。结果：1.琼脂糖凝胶电泳显示,b、c、d、e、f的实验组在与阳性对照组一致的位置上出现了条带,而a和g的实验组未出现条带。2.在抗坏血酸特异性培养基中,S. mutans UA159菌株的sgaT, ptxB, ptxA,SMU.273,SMU.274,SMU.2乃基因的mRNA表达量均显著上升,差异具有统计学意义(P0.01)。3.与野生型S. mutans相比,ptxB基因缺陷菌株中ptxA基因的mRNA相对表达量值明显下降,差异具有统计学意义(P0.01)。结论：1. S. mutans的ptxA、ptxB基因与其上游的sgaT基因,及其下游的SMU.273,SMU.274,SMU.275基因属于同一个操纵子,且抗坏血酸可能为该操纵子的诱导剂。2. ptxA基因的表达可受其上游ptxB基因的调控。
【关键词】：变异链球菌 ptxA基因 ptxB基因 磷酸转移酶系统 抗坏血酸
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781.1
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-22
• 第一章 变异链球菌ptxA、ptxB基因缺陷菌株及其功能补偿菌株的构建22-46
• 1 材料和方法22-37
• 2 结果37-43
• 3 讨论43-46
• 第二章 变异链球菌ptxA、ptxB基因对其生物学特性的影响46-57
• 1 材料和方法46-50
• 2 结果50-55
• 3 讨论55-57
• 第三章 变异链球菌ptxA、ptxB及其邻近基因转录情况的研究57-70
• 1 材料和方法57-66
• 2 结果66-68
• 3 讨论68-70
• 全文总结70-71
• 参考文献71-78
• 中英文对照缩略词表78-79
• 成果79-81
• 致谢81-83

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本文编号：837095