基于细胞膜片技术构建无支架组织工程血管化骨的实验研究

发布时间：2017-09-14 00:25

  本文关键词：基于细胞膜片技术构建无支架组织工程血管化骨的实验研究

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【摘要】：目的：探讨完全利用原代大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells BMSCs)体外构建无支架组织工程血管化骨,并用于修复大鼠颅骨临界骨缺损的可行性。方法：(1)BMSCs的体外培养与生长特性的观察：全骨髓贴壁法分离,培养,纯化BMSCs,利用倒置显微镜观察其生长特性并拍照。(2)BMSCs向内皮细胞诱导分化：将第2代纯化的BMSCs采用内皮细胞诱导培养液诱导14天,倒置显微镜观察其生长特性,并通过流式细胞仪鉴定诱导形成的内皮细胞(Endothelial cells ECs)。(3)预血管化膜片的构建：将第2代纯化的BMSCs以9×104/cm2的密度接种于六孔板,并在体外连续培养2周形成未分化膜片,将诱导形成的ECs细胞以5×104/cm2的密度均匀接种于未分化膜片,在内皮细胞诱导培养液中培养3天,倒置相差显微镜下观察内皮细胞在未分化膜片上的分布情况。(4)三维血管化无支架组织工程骨的构建：通过细胞刮刀刮取预血管化膜片,利用镊子将完整的预血管化膜片提起并平铺到成骨细胞膜片表面,通过成骨细胞膜片卷曲包裹预血管化膜片,形成三维血管化复合膜片,作为实验组；将未分化膜片平铺到成骨细胞膜片表面,通过成骨细胞膜片卷曲包裹未分化膜片,形成三维复合膜片,作为对照组。(5)实验组和对照组膜片用于修复大鼠颅骨缺损：利用牙科钻制取直径8mmm的大鼠颅骨全层圆形缺损,并将实验组和对照组复合膜片植入颅骨缺损处。并于术后2周、4周、8周通过大体观察、HE染色、CD-31染色、X线检测、Van Gieson染色及Trap染色检测植入膜片的成血管和成骨能力。结果：(1)我们成功地培养出了大鼠BMSCs,该细胞呈长梭形,多克隆样生长(2)纯化的BMSCs(?)在内皮细胞诱导液中向ECs诱导分化,镜下可见诱导形成的ECs呈典型的“铺路石”样生长方式生长,流式细胞检测显示大约有38%的细胞表达CD-31阳性。(3)进一步将诱导形成的ECs均匀的接种至未分化膜片上,3天后,倒置相差显微镜以及CD-31免疫荧光染色显示在其表面有空泡样结构的形成。(4)术后2周,HE染色和CD-31免疫组化染色显示,实验组新生的血管较对照组显著增多,术后4周和8周,通过HE和van-Gieson染色显示,实验组新骨形成量明显较对照组多,并且实验组和对照组的破骨细胞染色结果均呈阳性。结论：(1)本实验证明通过全骨髓贴壁法能够获取较纯的大鼠BMSCs,较之于其他实验方法,该方法更方便,且费用较低。(2)通过培养基中加入血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor b-FGF)能够诱导BMSCs向内皮细胞样细胞分化,并且,诱导形成的ECs不管在形态和特征上都与内皮细胞相似。(3)在未分化膜片上接种BMSCs诱导形成的ECs,体外能够构建出预血管化膜片。(4)体外构建的复合膜片植入大鼠颅骨缺损区能形成大量与宿主血管吻合良好的毛细血管,同时有新生骨组织的形成,较之于无血管化三维复合膜片,有效修复了大鼠颅骨临界骨缺损。本实验为无支架组织工程骨的构建提供了一个新的策略。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 组织工程骨 细胞膜片预血管化
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R782.2
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 附录7-10
• 前言10-12
• 文献回顾12-17
• 一 BMSCs向ECs诱导的研究现状12-13
• 二 细胞膜片技术的机制原理13
• 三 利用细胞膜片技术构建组织工程骨的研究现状13-15
• 四 细胞膜片作为仿生骨膜,促进骨缺损的修复15
• 五 细胞膜片在组织工程血管化领域的研究现状15-17
• 实验一 大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外培养与干细胞膜片的构建17-25
• 1. 实验材料17-18
• 2 实验方法18-20
• 3 实验结果20-22
• 4 实验讨论22-25
• 实验二 大鼠骨髓间充质干细胞预血管化膜片构建25-31
• 1 实验材料25-26
• 2 实验方法26-27
• 3 实验结果27-29
• 4 实验讨论29-31
• 实验三 基于细胞膜片构建无支架组织工程血管化骨修复大鼠颅骨临界极限缺损31-41
• 1 实验材料31-32
• 2 实验方法32-34
• 3 实验结果34-39
• 4 讨论39-40
• 5 结论40-41
• 参考文献41-46
• 病例汇报46-52
• 研究生期间的研究成果52-53
• 致谢53

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