孢子丝菌病的流行病学分析及T-DNA插入突变体的研究

发布时间：2017-10-19 13:27

  本文关键词：孢子丝菌病的流行病学分析及T-DNA插入突变体的研究

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【摘要】：孢子丝菌病是一种由申克孢子丝菌引起的皮肤真菌病，偶可播散至内脏引起全身播散型感染。对孢子丝菌病进行有效的防治，首先要明确其流行病学和病原学特点。我国孢子丝菌病多发生于东北地区，吉林省是孢子丝菌病的高发区。近年来，申克孢子丝菌引起的皮肤真菌病的发病率呈上升趋势，了解吉林省孢子丝菌病的流行病学特点对今后孢子丝菌病的预防和治疗具有重要意义。 从分子水平研究申克孢子丝菌的基因功能，有助于揭示其病原学特征和致病机制。利用分子标签获得突变体是进行基因功能研究的有效手段。根癌农杆菌介导的T-DNA插入突变技术（ATMT）具有转化受体类别多、转化效率高、突变体遗传稳定、操作简单等优点而被广泛应用于丝状真菌基因功能的研究。 本研究将ATMT技术用于申克孢子丝菌的研究，优化了孢子悬液浓度、农杆菌的诱导时间以及共培养介质等影响转化效率的因素，提高了T-DNA的转化效率，建立了申克孢子丝菌T-DNA插入突变体库。通过筛选获得了一些表型明显变化的突变体，利用TAIL-PCR方法获得T-DNA插入侧翼序列，定位插入位点，进而分析突变体的基因功能。其中，突变体841是一株铜转运蛋白基因被打断的突变体，本研究推测铜转运蛋白基因参与调控申克孢子丝菌的生长和抗氧化应激的能力，并与申克孢子丝菌的致病力有关。 1.孢子丝菌病的流行病学分析 了解孢子丝菌病的流行病学特点，对于控制和预防孢子丝菌病的发生具有重要意义。本研究对208例孢子丝菌病患者进行了流行病学分析。结果表明，女性发病率较高，男女发病比率为1:1.51。发病年龄最小为3岁，最大为87岁，平均年龄为47岁，各年龄段均可感染该病。青壮年发病率最高（67.3％），其次是老年人（27.9％），未成年人发病率最低（12.5％）。农民占大多数（68.6％），且多有外伤史。固定型孢子丝菌病常见，其次是淋巴管型，播散型少见，仅有1例。发病部位以面部和上肢为主，固定型多发生在面部和上肢，淋巴管型多发生在上肢，播散型表现为全身感染。冬季发病率最高（37.5％），冬季为孢子丝菌病的高发季节。 2.根癌农杆菌介导的申克孢子丝菌转化体系的优化及突变体的分析 本研究优化了影响根癌农杆菌介导的申克孢子丝菌转化效率的关键因素，建立了稳定、高效的申克孢子丝菌转化体系:（1）诱导条件：根癌农杆菌的初始OD600nm为0.3，乙酰丁香酮浓度为200μM,诱导时间为6h；（2）共培养介质和条件：申克孢子丝菌孢子浓度为106个/ml,乙酰丁香酮浓度为200μM，孢子悬液和诱导6h的农杆菌以1：1混合，，均匀涂布于含微孔滤膜的共培养基上，25℃培养48h；（3）筛选培养条件：25℃培养4天。在上述转化条件下，转化效率可达1000-1200个突变体/106个孢子。本研究获得了4500株突变体，初步建立了申克孢子丝菌的突变体库。T-DNA插入突变体的遗传稳定性高，可通过有丝分裂稳定遗传。从突变体库中筛选出7株表型变化明显的突变体，并成功扩增其T-DNA插入侧翼序列，利用生物信息学分析被打断基因的功能。 3.申克孢子丝菌铜转运蛋白基因功能研究 微量元素铜是微生物维持自身生长和发育不可缺少的重要条件。在多数蛋白质发挥功能时，铜担当着重要角色。本研究筛选出一株表型变化明显的突变体，通过TAIL-PCR方法获得了T-DNA插入侧翼序列。通过生物信息学分析，与稻瘟病菌、马尔尼菲青霉、黑曲霉、巴西副球孢子菌等真菌的铜转运蛋白基因同源性较高，命名为CTP基因。利用genebank数据库设计随机简并引物，本研究成功克隆出该基因片段，长度为1300bp。光学显微镜下可见突变体841的形态发生较大变化，菌丝较细，排列杂乱，分生孢子数量减少，易脱落。与野生型相比，突变体841生长速度无变化，但其酵母相的转化能力变弱，且对过氧化氢敏感，抗氧化应激能力下降。在小鼠系统性感染模型中，突变体841表现出较低的致病力。这些结果表明铜转运蛋白基因调控了申克孢子丝菌的生长和抗氧化应激的能力，并且与致病力相关。
【关键词】：孢子丝菌病 申克孢子丝菌 流行病学 T-DNA 突变体
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R756;R181.3
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 英文缩写词表9-13
• 第1章 绪论13-22
• 1.1 申克孢子丝菌和孢子丝菌病13-16
• 1.1.1 申克孢子丝菌的分类学研究13
• 1.1.2 申克孢子丝菌的形态学研究13-14
• 1.1.3 孢子丝菌病的发病机制14-15
• 1.1.4 孢子丝菌病的流行病学研究15-16
• 1.2 真菌 T-DNA 插入突变的研究进展16-20
• 1.2.1 突变体库的构建方法研究进展16-17
• 1.2.2 农杆菌介导的丝状真菌的遗传转化的特点17-18
• 1.2.3 T-DNA 插入侧翼序列的分离方法18-20
• 1.3 铜转运蛋白基因的研究进展20-22
• 第2章 孢子丝菌病的流行病学分析22-28
• 2.1 材料22
• 2.1.1 标本收集22
• 2.2 方法22
• 2.2.1 统计学方法22
• 2.3 结果22-26
• 2.3.1 性别与年龄22-23
• 2.3.2 职业与外伤史23
• 2.3.3 临床表现及发病部位23-25
• 2.3.4 发病季节25
• 2.3.5 分布区域25-26
• 2.4 讨论26-28
• 第3章 根癌农杆菌介导的申克孢子丝菌转化体系的优化及突变体的分析28-45
• 3.1 材料28-30
• 3.1.1 菌株和质粒28
• 3.1.2 培养基及配置方法28-29
• 3.1.3 试剂与引物29-30
• 3.2 仪器设备30
• 3.3 方法30-33
• 3.3.1 突变体筛选所需潮霉素 B 的浓度30
• 3.3.2 抑制根癌农杆菌生长所需头孢菌素的浓度30-31
• 3.3.3 根癌农杆菌 AGL-1 的活化和诱导培养31
• 3.3.4 申克孢子丝菌 JLCC32757 分生孢子的培养31
• 3.3.5 根癌农杆菌 AGL-1 转化申克孢子丝菌的步骤31
• 3.3.6 突变体的遗传稳定性分析31-32
• 3.3.7 申克孢子丝菌及突变体菌丝体的培养和收集32
• 3.3.8 申克孢子丝菌基因组 DNA 的提取32
• 3.3.9 菌落表型变化突变体的筛选及 T-DNA 侧翼序列分析32-33
• 3.4 结果33-42
• 3.4.1 潮霉素 B 对申克孢子丝菌孢子萌发的抑制作用33-34
• 3.4.2 头孢菌素对根癌农杆菌生长的抑制作用34-35
• 3.4.3 突变体的遗传稳定性分析35
• 3.4.4 根癌农杆菌介导的申克孢子丝菌转化体系的优化35-40
• 3.4.5 根癌农杆菌介导的申克孢子丝菌转化体系的确定和突变体库的构建40-41
• 3.4.6 表现变化突变体的筛选及其 T-DNA 侧翼序列的扩增41-42
• 3.4.7 表型变化突变体 T-DNA 插入侧翼序列的生物信息学分析42
• 3.5 讨论42-45
• 第4章 申克孢子丝菌铜转运蛋白基因的功能研究45-59
• 4.1 材料45-46
• 4.1.1 菌株和实验动物45
• 4.1.2 试剂及引物45-46
• 4.2 仪器设备46-47
• 4.3 方法47-49
• 4.3.1 申克孢子丝菌菌丝体的培养和收集47
• 4.3.2 申克孢子丝菌基因组 DNA 的提取47
• 4.3.3 申克孢子丝菌基因组 RNA 的提取47
• 4.3.4 突变体 841 潮霉素基因的扩增47
• 4.3.5 突变体 841T-DNA 侧翼序列的扩增及生物信息学分析47
• 4.3.6 申克孢子丝菌及突变株 841 的形态观察47-48
• 4.3.7 实时荧光定量分析 CTP 基因的表达量48
• 4.3.8 申克孢子丝菌尾静脉感染小鼠实验48-49
• 4.4 结果49-57
• 4.4.1 突变体 841 的潮霉素抗性基因扩增结果49
• 4.4.2 突变体 841T-DNA 插入侧翼序列扩增和生物信息学分析49-51
• 4.4.3 突变体 841 的形态观察51-53
• 4.4.4 实时荧光定量分析 CTP 基因的表达量53-54
• 4.4.5 突变体 841 的致病力分析54-57
• 4.5 讨论57-59
• 第5章 结论59-60
• 参考文献60-68
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果68-69
• 致谢69

【参考文献】

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1 刘秀颖;何秀萍;卢莹;张博润;;基于基因组DNA诱变的遗传重组改造乙醇工业酵母的耐热性及发酵性能[J];生物工程学报;2011年07期

本文编号：1061357