视蛋白基因参与蚊抗药性机制的研究

发布时间：2017-12-10 20:34

  本文关键词：视蛋白基因参与蚊抗药性机制的研究

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【摘要】：杀虫剂的连续、大量使用导致了虫媒抗药性的发生和发展，进而加剧了虫媒病传播的恶化趋势。鉴定新的抗药性基因、阐明抗药性机制是有效治理虫媒抗药性的前提和必要条件。 本研究根据已知的埃及伊蚊（Aedes aegypti）和淡色库蚊（Culex pipienspallens）Opsin基因序列，设计简并引物，从白纹伊蚊(Ae. albopictus)C6/36细胞中扩增出白纹伊蚊Opsin基因的开放阅读框（ORF）序列，T/A克隆入pCR2.1载体并测序。获得白纹伊蚊Opsin基因ORF序列为1122bp，编码373个氨基酸（NCBI/GenBank JQ354934，2012）。 用BlastX软件将该基因推导编码的氨基酸序列与蛋白质公共数据库Swissprot分析，用ClustalW软件作序列比对和聚类分析。推导的氨基酸序列与埃及伊蚊、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）、淡色库蚊的视蛋白分别具有95%、91%和87%以上的同源性。 将白纹伊蚊Opsin转染白纹伊蚊C6/36细胞，使其在蚊细胞中高表达，结果发现，，在溴氰菊酯浓度为101.5μg/mL，102.0μg/mL和102.5μg/mL时，opsin转染组细胞的存活率分别比对照组增高了22%，14%，21%（p0.05）。采用siRNA技术干涉白纹伊蚊C6/36细胞的Opsin基因，通过实时定量PCR实验验证，干涉Opsin基因的效率为81%，在溴氰菊酯浓度为101.5μg/mL，102.0μg/mL和102.5μg/mL时，干涉组细胞的存活率分别比对照组下降15%、16%和21%（p 0.05）。结果进一步证实，白纹伊蚊Opsin与蚊溴氰菊酯抗性有关，是一个新的杀虫剂抗性基因。 为进一步研究Opsin参与蚊溴氰菊酯抗性形成的机制，本研究在蚊细胞中将Opsin分别高表达和低表达后，采用实时定量PCR法检测与Opsin相关的GPCR通路中Arrestin、Gqα基因及代谢抗性基因CYP6A1的表达，同时检测了PLC酶活性的变化。结果显示，与对照组相比，Opsin基因高表达后，Arrestin基因表达无差异，Gqα基因、CYP6A1基因分别高表达12倍和99倍，PLC酶活性增高了2.56倍（p0.05）；Opsin基因低表达后，Arrestin基因表达无差异，Gqα基因、CYP6A1基因表达分别降低了82%和81%，PLC酶活性降低了63%（p0.05）。以上结果提示，Opsin基因可能通过影响Gqα基因表达及PLC酶活性，调节代谢酶基因CYP6A1的表达，从而促进代谢酶对杀虫剂的降解而对蚊细胞有保护作用。进一步采用实时定量PCR技术，分析Opsin、Arrestin、Gqα、PLC基因在蚊活体抗性品系和敏感品系中的表达差异。结果蚊活体与蚊细胞一致，Opsin、Arrestin、Gqα、PLC基因在淡色库蚊抗性蚊中的表达分别是敏感蚊的10.42、5.64、3.34、2.16倍（p0.05）。Western blotting技术检测发现Opsin蛋白在无锡、塘口抗性蚊中较相应敏感蚊高表达。本实验室邹萍等在研究Arrestin基因与蚊溴氰菊酯抗性的关系时发现，当Arrestin基因在蚊细胞内高表达后，溴氰菊酯处理后的细胞存活率、Opsin基因与CYP6A1基因表达均增高；Arrestin基因低表达后，细胞存活率、Opsin基因与CYP6A1基因表达均降低。综合以上结果提示，GPCR信号通路可能作为一种新的机制参与了蚊抗药性的形成，即Arrestin可调控Opsin的表达，进而通过调控Gqα及PLC酶活性，影响CYP6A1基因的表达而导致蚊对溴氰菊酯抗性。 以淡色库蚊活体为研究对象，采用实时定量PCR技术，研究不同地区溴氰菊酯抗性和敏感蚊、对溴氰菊酯不同抗性水平的蚊、对不同杀虫剂抗性蚊中Opsin基因的表达水平。结果显示，无锡抗性蚊中Opsin基因表达是敏感蚊的5.81倍（p0.05），用接触筒法区分的南京抗性蚊中Opsin基因表达是敏感蚊的4.53倍（p0.05）。经溴氰菊酯逐代筛选的塘口抗性蚊（LC50分别为0.05、0.1、0.5、0.55ppm）中Opsin基因表达分别是敏感蚊（LC500.02ppm）的1.30、2.50、3.99、10.42倍（p0.05）。济宁对氯氰菊酯抗性蚊、对DDVP抗性蚊、对残杀威抗性蚊中Opsin基因的表达分别是敏感蚊的4.46、10.00、23.05倍（p0.05）。分别提取塘口、无锡对溴氰菊酯抗性蚊和敏感蚊的全蛋白，采用Western blotting技术检测Opsin、Arrestin蛋白表达差异，结果发现Opsin蛋白在塘口、无锡抗性蚊中较相应敏感蚊高表达1.94及1.68倍， Arrestin蛋白在塘口、无锡抗性蚊中的表达量分别是相应敏感蚊的1.20及1.10倍。以上结果提示，Opsin基因在杀虫剂抗性蚊中高表达是一种普遍现象，其有望作为蚊抗药性检测的潜在靶标，值得进一步研究。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R184

【参考文献】

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本文编号：1275852